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1、中国3000万经理人首选培训网站降纤酶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳操作规程 目的： 建立降纤酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作规程，保证正确操作。 2. 依据： 中华人民共和国卫生部标准（试行）（97）卫药标字01号。 3. 范围： 适用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定降纤酶分子量及纯度的操作。 4. 职责： QC检验员对本标准的实施负责。5. 程序： 5.1. 定义：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量，是根据大多数蛋白都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应，使蛋白分子相对迁移率（R

2、f）的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。5.2. 仪器装置：由稳压电泳仪和垂直板电泳槽组成。5.3. 试剂与仪器：-巯基乙醇、丙烯酰胺、N，N 亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠（SDS）、溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵、三氯醋酸、甲醇、考马斯亮蓝R-250、甘油、盐酸、醋酸、四甲基乙二胺。烧杯、刻度吸管、微量移液器。5.4. 溶液的配制：5.4.1. 丙烯酰胺N，N亚甲基双丙烯酰胺贮备溶液：称取丙烯酰胺29.2g。N、N亚甲基双丙烯酰胺 0.8g，加水溶解，并稀释至100ml，过滤至棕色瓶中，4保存。5.4

3、.2. 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加水溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至8.8，加水稀释至100ml，4保存。5.4.3. 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8）：量取上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8）适量，加水（1：3）稀释，用2mol/L盐酸液调节pH值至6.8，4保存。5.4.4. 10%十二烷基硫酸钠溶液：称取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解，并稀释至100ml，室温保存。5.4.5. 供试品缓冲液： 水 4.8ml 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(6.8) 1.2ml 甘油 1.0ml 10%SDS溶液 2.0ml 0.5%(W/V)溴酚

4、蓝溶液 0.5ml -巯基乙醇 0.5ml 总体积 10.0ml5.4.6. 电极贮存液（pH8.3）：称取三羟甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，SDS5g，加水溶解，并稀释至1000ml，4保存。临用前稀释5倍。5.4.7. 10%过硫酸铵（临用前配制）：称取过硫酸铵1g，加水溶解并稀释至10ml。5.4.8. 固定液：称取5g三氯醋酸，加水200ml溶解，加甲醇200ml，再加水至500ml。5.4.9. 染色液，称取0.5g考马斯亮蓝R-250，溶于200ml水中，量取甲醇200ml与醋酸50ml，三液合并，加水至500ml。5.4.10. 脱色液：量取甲醇400ml、醋酸100ml，加

5、水至1000ml，充分混合。5.4.11. 保存液：量取甲醇400ml、醋酸100ml与甘油100ml，加水至1000ml充分混合。5.5. 凝胶的制备：5.5.1. 分离胶的制备（12%）： 水 3.35ml 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.8） 2.5ml 10%SDS 100l 丙烯酰胺N, N 亚甲基双丙烯酰胺贮备液 4.0m l 脱气15分钟以上 10%过硫酸铵 50l 四甲基乙二胺 5l将分离胶充分混合后，小心地倒入胶膜中，再在胶面上覆上一层水，水平静置直至胶体凝固。5.5.2. 浓缩胶的配制： 水 6.1ml 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH6.8） 2.5ml 10%SDS 100

6、l 丙烯酰胺N，N 亚甲基双丙烯酰胺贮备液 1.3ml 脱气15分钟以上 10%过硫酸铵 50l 四甲基乙二胺 10l将分离胶上的水层去掉，倒入混合好的浓缩胶，插入“梳子”，“梳子”底部与分离胶的前沿相距约1cm，水平放置直到胶体凝固。 5.6. 供试品的制备： 5.6.1. 标准蛋白溶液：按标准蛋白的蛋白含量，加供试品缓冲液制成每1l中含1g蛋白的标准蛋白溶液。临用前置沸水浴中5分钟，冷却。 5.6.2. 供试品溶液：按供试品的蛋白含量，加供试品缓冲液制成每1l中含1g蛋白的标准蛋白溶液。临用前置沸水浴中5分钟，冷却。电 泳：凝胶板制好后，取出梳子，各孔加510l 的供试品溶液或标准蛋白溶液

7、，倒入电极缓冲液，接通电源，调节起始电压100伏以下进行电泳，数分钟后，待样品进入分离胶以后，加大电压至200伏电泳，直到溴酚蓝接近胶板底部时，关闭电源，停止电泳，取下胶板。用尺子量出分离胶的长度并记录，同时在溴酚蓝前沿处做标记。5.8. 胶板的处理：5.8.1. 将胶板置于固定液中，固定至溴酚蓝变成黄色（约1530分钟）。5.8.2. 将固定后的胶板置于染色液中，于37染色约23小时。5.8.3. 将染色的胶板置于脱色液中，不断更换脱色液直至蓝色背景脱净。5.8.4. 将胶板观察结果、记录、编号，然后保存于保存液中。5.9. 结果观察及数据处理：5.9.1. 观察胶面有几条电泳带，依据质量标准做出判断。5.9.2. 以标准蛋白分子量的对数为纵坐标，以相对迁移率为横坐标，线性回归作出标准曲线，将供试品的相对迁移率代入回归方程，求得供试品的分子量。 计算公式： Rf=L1×L3L2L4 式中：Rf 为标准蛋白或供试品的相对迁移率； L1为标准蛋白或供试品移动的距离； L2为溴酚蓝前沿的距离； L3为染色前分离胶的长度； L4为脱色后分离胶的长度。 M =10Rf·b+a 式中：M为供试品的分子量； Rf为供试品的相对迁移率； a为回归方程的截距； b为回归方程的斜率。更多免费资料下载请进：好好学习社区