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1、激光心肌血管重建术结合转染血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血的实验研究【摘要】目的探讨激光心肌血管重建术（transmyocardial laser revascularization, TMLR）与转血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因相结合能否更有效地改善心肌缺血。方法 在猪的急性心肌缺血模型上行TMLR，实验组在孔道边缘心肌内注射VEGF裸质粒2 mg，对照组注射等体积灭菌水。术后4周、8周取材。RT-PCR、免疫组化检测VEGF mRNA、蛋白表达；碱性磷酸酶组化法显示新生血管。结果术后4周VEGF mRNA、蛋白水平实

2、验组高于对照组；8周时两组表达均显著下降。血管计数实验组4周(49.611.5)/mm2，对照组4周(26.44.1)/mm2; 实验组8周(59.78.0)/mm2；，对照组8周(28.72.9)/mm2。实验组新生血管多于对照组。结论与TMLR相比，TMLR结合转染VEGF基因能提高VEGF表达，促进新生血管形成。【关键词】心肌血管重建术；?内皮生长因子;?基因;?心肌缺血 Transmyocardial laser revascularization combined with VEGF gene therapy for myocardial ischemiaGUO Jingxuan,

3、ZHANG Ping, LEI Li（Department of Cardiology, Third Hospital, Beijing University, Beijing 100083, China）【Abstract】ObjectiveTo investigate whether transmyocardial laser revascularization (TMLR) combined with vascular endothelial growth factor (VEGF) gene therapy may further angiogenesis induced by TML

4、R alone. MethodsAcute myocardial ischemia was created in procine hearts by ligating left anterior descending artery with preceding ischemia preconditioning. Twelve pigs were randomized to TMLR+VEGF group (n=7) or TMLR alone group (n=5). Four to five transmural channels were performed on ischemic myo

5、cardium with Nd:YAG laser (=1.064 nm). Optical fiber diameter was 1 000 m. Intramyocardial injections were placed in the vicinity of channels. The TMLR+VEGF group used pcD2/VEGF 121 expression plasmid (800 l, 2.5 mg/ml). The TMLR alone group used sterile distilled water (800 l). Animals were sacrifi

6、ced 4 weeks or 8 weeks post therapy. VEGF mRNA was detected with RTPCR. VEGF protein was detected with immunohistochemistry. Blood vessels were stained with alkaline phosphatase histochemistry. ResultsTMLR+VEGF group has a significant higher level of VEGF mRNA and protein expression compared with TM

7、LR alone group 4 weeks post therapy. Eight weeks post therapy VEGF mRNA and protein decreased significantly in both groups. Vascular density was significantly elevated in TMLR+VEGF group compared with TMLR alone group (4 weeks post therapy: TMLR+VEGF group 49.611.5/mm2 ,TMLR alone group 26.44.1/ mm2

8、; 8 weeks post therapy: TMLR+VEGF group 59.78.0/mm2; TMLR alone group 28.72.9/mm2). ConclusionCompared with TMLR alone, TMLR combined with VEGF gene therapy can enhance VEGF expression and further angiogenesis.【Key words】Myocardial revascularization;?Endothelial growth factor;?Gene;?Myocardial ische

9、mia对于冠状动脉弥漫性病变或末梢病变、药物治疗无效又不具备经皮冠状动脉成形术（PTCA）和冠状动脉旁路移植术（CABG）条件的冠心病患者，激光心肌血管重建术（transmyocardial laser revasculariza- tion, TMLR）已为越来越多的临床医生和研究者所关注。TMLR最主要的作用机制是血管新生。我们的前期工作发现，TMLR可通过诱导内源性血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）等促使新生血管形成1。VE

10、GF是已知作用最强且特异的血管生长因子。大量研究证实心肌内注射VEGF质粒可获得有效表达。我们预期在TMLR的基础上转染给予外源性VEGF基因能进一步促新生血管形成，从而更有效地改善心肌缺血。首先在急性心肌缺血的模型上观察了TMLR与转VEGF基因相结合的疗效。材料与方法1动物实验：健康小型猪(中国农业大学提供，平均体重15 kg), 氯胺酮20 mg/kg、地西泮20 mg肌注诱导麻醉。气管插管，接呼吸机。5%戊巴比妥钠缓慢静推维持麻醉。青霉素480万单位静滴预防感染。左第四肋间开胸暴露心脏。缺血预适应后，于前降支中、下1/3处结扎。随后在缺血心肌边缘用Nd：YAG激光打45孔，孔间距约1

11、cm。打孔完毕，于孔道边缘约5 mm处注射pcD2/VEGF121质粒2 000 g，浓度2.5 mg/ml,体积800 l（实验组，n=7）或灭菌水800 l（对照组，n=5）。随后在孔道周边用5-0聚丙烯不吸收线标记。分别于术后4周、8周取材。2激光参数：钕：钇铝石榴石（Nd：YAG）调制激光仪（中科院电子所、北京大学第三医院联合研制），激光波长1.064 m, 脉冲能量1 mJ, 峰值功率2104 W, 平均功率25 W。传输系统采用裸露石英光导纤维，光纤直径1 000 m, 接触式操作。3pcD2/VEGF121质粒DNA的提取、纯化与鉴定：含pcD2/VEGF121质粒的大肠杆菌菌种

12、由北京大学医学部心血管基础所馈赠。碱裂解后用QIAGEN10000柱提取、纯化。用灭菌水溶解质粒DNA。紫外分光光度计定量，OD260/OD280为1.8。质粒经BamH I与Xba I双酶切，产物0.8琼脂糖凝胶电泳，以DNA/Hind为分子量标识，紫外灯下550 bp的条带为VEGF。提取的质粒-30冻存，用前解冻。4VEGF mRNA水平的检测：采用RT-PCR法，于标记处取材，液氮保存。匀浆后用Trizol提取RNA。2 g用于逆转录。取2.5 l逆转录产物做PCR。VEGF正义引物序列：5-GGG GGA TCC GCC TCC GAA ACC ATG AAC TT-3, 反义引物序

13、列：5-CCC GAA TTC TCC TGG TGA GAG ATC TGG TT-3，扩增长度550 bp。同时用GAPDH引物行PCR作为内参照，GAPDH正义引物序列：5-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3, 反义引物序列：5-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3, 扩增长度309 bp。PCR程序：94预变性5 min；随后9430 s，5545 s，7255 s，共35个循环；终末延伸725 min。产物经0.8琼脂糖凝胶电泳，DNA/Hind为分子量标识。5VEGF蛋白水平的检测：采用免疫组化法，于标记处取材，10中性缓冲福尔马林固定，石

14、蜡包埋。切片厚6 m, SP法做免疫组化，DAB显色。VEGF抗体购自Santa Cruz公司,工作浓度20 g/ml。6血管新生：碱性磷酸酶组化法，标本OCT包埋，液氮速冻后-30保存。冰冻切片，切片厚6m。室温晾干切片，于碱性磷酸酶染液（BCIP 0.2 mg/ml，NBT 0.5 mg/ml，0.1 mmol/L Tris-Cl缓冲液配制，pH 9.2）中37孵育10 min。流水冲洗终止反应，伊红复染，甘油明胶封片。7 统计分析：采用成组设计的两样本均数比较的t检验，P0.05为差异有显著性。结果1.VEGF mRNA水平的检测：RT-PCR结果显示，各组GAPDH条带亮度及面积相当。

15、而VEGF条带实验组4周明显较对照组4周亮、宽。表明4周时实验组VEGF mRNA 水平显著高于对照组。8周时两组VEGF mRNA表达显著下降，均无明显的条带（1）。1RT-PCR检测 VEGF mRNA表达(1:DNA/Hind Marker；2: 对照组4周；3:实验组4周；4:对照组8周；5. 实验组8周)2VEGF蛋白水平的检测：VEGF免疫反应阳性颗粒为胞浆内的棕黄色颗粒沉淀。实验组4周时，大部分心肌细胞胞浆内可见阳性颗粒沉着，且胞浆内阳性颗粒多；而对照组仅小部分心肌细胞胞浆内有阳性颗粒沉着，胞浆内阳性颗粒也较少（2）。表明4周时实验组VEGF蛋白表达水平显著高于对照组。8周时实验

16、组与对照组VEGF表达均明显下降，仅少数细胞内有阳性颗粒，两组无显著性差异。3新生血管计数：染色后心肌细胞呈红色，血管呈蓝黑色。每只动物取5块组织切片。每张切片随机选取12个视野，其中血管为纵切面的视野排除在外。高倍镜下（400）计新生血管数。实验组4周（49.611.5）/mm2，对照组4周（26.44.1）/mm2; 实验组8周（59.78.0）/mm2；，对照组8周（28.72.9）/mm2。实验组血管多于对照组。讨论TMLR可使药物、介入及冠状动脉搭桥等多种治疗无效的冠心病患者心绞痛缓解、生活质量提高。目前认为TMLR最主要的作用机制是通过诱导VEGF、bFGF等血管生长因子表达，促新

17、生血管形成，从而改善了心肌缺血。但TMLR对心肌灌注、功能的影响均不确切，可能与TMLR不能完全重建缺血心肌血运有关。心肌内注射促血管生长因子的蛋白或基因可促进新生血管形成，改善心肌缺血，是冠心病治疗的又一进展。近年来研究者尝试了将TMLR与心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子(HGF)等促血管生长因子相结合，证实了二者结合的有效性2，3。VEGF是已知作用最强且特异的血管生长因子，早有研究者尝试了将TMLR与注射VEGF蛋白相结合，却发现血管新生并未如预期的那样进一步增加4。我们分析这是由于VEGF蛋白半衰期短，TMLR时1次给药不足以起效。大量研究证实心肌内注射VE

18、GF质粒可获得有效的持续表达。因此我们推断，将TMLR与转VEGF基因结合可能进一步提高心肌内VEGF表达水平，使新生血管形成增加，进而改善缺血心肌的灌注及功能，提高TMLR远期疗效。我们的初步实验结果证实：（1）TMLR的同时在激光孔道周边注射VEGF质粒可使缺血心肌VEGF基因转录、翻译水平进一步增高；（2）表达的蛋白具有生物学功能，促使新生血管形成增加。这种新生的小血管脆弱、易于破裂，不能适应生理状况下增加心肌灌注的需要。TMLR结合转VEGF基因能否使侧支循环增多、缺血心肌灌注与功能改善仍需实验证实。为此我们还用冠状动脉造影、超声心动观察了侧支循环与心功能的变化，目前资料正在整理中。本

19、实验以急性心肌缺血为模型，这与冠心病患者的慢性缺血有所不同。急性心肌缺血时由于心肌VEGF表达迅速增加，VEGF受体上调、增敏，有助于新生血管的形成。慢性缺血时能否获得同样的效果有待下一步研究。此外，TMLR与转VEGF基因结合的促血管新生作用虽然比TMLR强，但是否比单纯心肌内注射VEGF质粒强还需研究证实。TMLR对外源性基因的表达起促进或限制作用尚无定论。Sayeed-Shah等5用热探针插入大鼠心脏模拟TMLR时激光对心肌的热损伤，然后在孔道周边不同距离处注射携带-半乳糖苷酶基因的裸质粒，发现在孔道周边一定距离处注射时-半乳糖苷酶基因表达最高，提示TMLR时利用激光造成的心肌热损伤区，

20、可能提高外源性基因的表达效率。但其他研究者则得到了相反的结果。Hughes等6在猪心上行TMLR, 然后注射携带-半乳糖苷酶基因的腺病毒，结果发现由于激光造成心肌损伤引起强烈的炎症反应，TMLR使外源性基因表达受限。得出最后的结论还需进行大量的实验及临床研究。2 VEGF免疫反应;2a实验组;2b对照组志谢北京大学医学部心血管基础所周爱儒教授对本研究工作的大力协助基金项目：卫生部基金资助(98-1-250)作者单位：郭静萱（北京大学第三医院心内科 100083）张萍（北京大学第三医院心内科 100083）雷莉（北京大学第三医院心内科 100083）冯新恒（北京大学第三医院心内科 100083）

21、孙威（北京大学第三医院心内科 100083）卢长林（北京大学第三医院心内科 100083）白若昀（北京大学第三医院心内科 100083）赵蕊（北京大学第三医院心内科 100083）牛杰（北京大学第三医院心内科 100083）陈凤荣（北京大学第三医院心内科 100083）毛节明（北京大学第三医院心内科 100083）参考文献1，郭静萱，黄璇，张萍, 等. 激光心肌血管重建术后血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子的变化. 北京医科大学学报，1999, 31：536-539. 2，Yamamoto N, Kohmoto T, Gu AG, et al. Basic fibroblast gr

22、owth factor enhances the angiogenic effects of transmyocardial laser revascularization. Circulation, 1998, 98:I-217. 3，Yamaguchi T, Matuda H, Takahashi T, et al. Hepatocyte growth factor enhances the effect of transmyocardial laser revascularization in the ischemic myocardium. Circulation, 1998, 98:

23、I-121. 4，Fleischer KJ, Goldschmidt-Clermont PJ, Fonger JD, et al. One-month histologic response of transmyocardial laser channels with molecular intervention. Ann Thorac Surg, 1996, 62:1051-1058. 5，Sayeed-Shah U, Mann MJ, Zhang L, et al. Nonviral gene transfer to enhance transmyocardial laser revascularization. Surg Forum, 1997, 48:251-254. 6，Hughes GC, Annex BH, Yin B, et al. Transmyocardial laser revascularization (TMR) limits in vivo adenoviral-mediated gene transfer in porcine myocardium. Cardiovasc Res, 1999, 44: 81-90. （收稿日期：2000-09-29）