kok电子竞技

1、 本科毕业论文 题 目 弓形虫烯醇化酶2基因的克隆与表达 学 院 生命科学技术学院 专 业 生物技术（动物方向） 毕业届别 2014届 姓 名 谢国华 指导教师 刘霞 副教授 张德林 研究员 甘肃农业大学教务处制二一四年五月目录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc356393746 摘要 III双酶切鉴定和PCR鉴定，切出约为1 335 bp的片段，与克隆的目的基因大小相符，表明成功的构建了pMD-ENO2重组质粒。（见图1） 图1. ENO2基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of ENO2 geneM. DNA标准分子量

2、；1.RT-PCR扩增产物M. DL2000 DNA Marker; 1. PCR product of SAG1 gene;3.2 pMD-ENO2重组质粒的酶切鉴定 pMD-ENO2重组质粒经EcoR I和Hind 双酶切鉴定和PCR鉴定，切出约为1 335 bp的片段，与克隆的目的基因大小相符，表明成功的构建了pMD-ENO2重组质粒。（见图2） 图2. PMD-18t-ENO2酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD-ENO2 by digestion with EcoR I +Hind M：分子质量标准；1. ENO2基因

3、PCR产物； 2.pMD-18T-ENO2 EcoRI单酶切； 3.pMD-18T-ENO2 Hind III单酶切；4.pMD-18T-ENO2 EcoR I/Hind III双酶切；5.pMD-18T-ENO2重组质粒M. DL2000 DNA Marker; 1.PCR product of ENO2 gene; 2. pMD-18T-ENO2 digested with EcoR I 3.pMD-18T-ENO2 digested with Hind ；4.pMD-18T-ENO2 digested with Hind /EcoR I； 5：Recombinant plasmid pM

4、D-18T-ENO23.3 pET-ENO2重组质粒的鉴定以重组质粒pMD-ENO2为模板，PCR扩增的目的片段约为1 335 bp。经连接转化后，用PCR扩增和双酶切（EcoR I和Hind）进行鉴定。产生两个片段，大小分别与酶切后的载体、PCR产物大小符合（图3），表明成功的构建了pET30a-ENO2重组质粒。 图3 重组质粒pET30a-ENO2的酶切鉴定Fig. 3 Identification of recombinant plasmid pET30a-ENO2 by restrictive enzymes digestionM.分子质量标准1.ENO2基因PCR产物；2.pET3

5、0a（+）；3.pET30a-ENO2重组质粒；4.pET30a-ENO2 EcoRI/HindIII双酶切；5.pET30a-ENO2 EcoRI单酶切；6.pET30a-ENO2 HindIII单酶切；M. DL10 000 and DL2 000 DNA Marker；1. PCR product of ENO2 gene； 2. pET30a（+）3. Recombinant plasmid pET30a-ENO2； 4. pET30a digested with EcoRI/Hind III；5. pET30a-ENO2 digested with EcoRI;6. pET30a-E

6、NO2 digested with Hind III3.4 ENO2基因表达产物SDS分析重组质粒转化菌株BL21（DE3）经IPTG诱导，表达产物进行SDS胶分析，出现48 kD的蛋白带，与理论值相符。结果如图4所示。图4.ENO2表达产物的SDS电泳分析Fig.4 SDSanalysis of the expressed recombinant ENO2M.蛋白分子质量；1.未诱导产物；2.诱导产物M.Protein molecular weight Marker;1.No IPTG induction;2.Expressed products4 讨论本实验中重组质粒的诱导表达采用异丙基硫

7、代半乳糖苷（IPTG），是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。在有IPTG诱导物存在的条件下，诱导物可与阻遏蛋白结合成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，阻遏蛋白就不能与O基结合，从而促进基因表达，提高表达量。IPTG在不同浓度，温度，诱导时间条件下，对表达产物量具有显著影响，本实验中IPTG终浓度为1.0 mmol/L，在37 诱导表达，3 h后收集菌液，经SDS电泳检测，从图4中可知：成功得到表达产物，且表达量较高。弓形虫的生理代谢均来自于糖酵解，本文所分析的弓形虫烯醇酶虽不属于糖酵解中的关键酶，却是该途径中的一个重要酶类，在细胞的能量代谢中具有重要的作用。同时

8、它又是一种多功能的蛋白:它具有热休克蛋白的功能7-10;能与细胞骨架蛋白和多聚核葺酸结合11；是纤溶酶原、层粘连蛋白的受体等10。己经证实，作为寄生虫分泌排泄抗原之一的烯醇酶可能参与了寄生虫与宿主之间的相互作用、因此可以确定该酶在寄生虫的能量代谢及与宿主之间的作用中具有很高的研究价值12。很多研究发现烯醇酶定位于细菌、真菌、原虫、蠕虫的表面，而分布在表膜的蛋白有可能成为药物的靶分子，或是诊断抗原的候选分子。此研究为弓形虫的诊断、药物及疫苗研究提供线索。本研究对弓形虫ENO2基因进行克隆表达，为下一步研制基于排泄分泌抗原的抗弓形虫重组疫苗奠定基础。参考文献（Reference）:1 赵云鹤.刚地

9、弓形虫致生殖毒性的研究进展J.热带医学杂志, 2006, 6(9): 1045-1047. 2 于恩庶.弓形虫病学M.福州:福建科学技术出版.1992, 125-238.3 孔繁瑶主编, 家畜寄生虫学M. 第二版. 北京: 中国农业大学出版社, 1997.4 Hafid J, Vincent N, Flori P, et al. Production of antibodies inmurine mucosal mmunization with Toxoplasma gondii excreted/secreted antigensJ. Vet Parasitol, 2005, 128(1-2

10、):23-28.5 张德林，李学瑞，王艳华，等弓形虫代谢分泌抗原在免疫中研究进展J中国人兽共患病学报，2007，23（12）：1259-12616 Costa-Silva TA, Meira CS, Ferreira IM, et al. Evaluation of immunization with tachyzoite excreted-secreted proteins in a novel susceptible mouse model (A/Sn) for Toxoplasma gondiiJ. Exp Parasitol, 2008, 120(3): 227-234.）7 Will

11、iams LA, Ding L, Horwitz J, et a1.Tau-crystallin from the turtle lens; puriFication and partial characterization J. Experi-mental Eye Research，1985, 40(5): 741-749.8 Takci N, Kondo J, Nagaikc K, et al. Ncuronal survival factor from bovine brain is identical to neuronspecific enolase J. J Neurochemis

12、try, 1991, 57(4): 1178-1184.9 al-Gicry AG, Brewer JM. Characterization of the interaction of yeast enolase with polynucleotidc J. Biochim Biophys Acta, 1992, 1159(2): 134-140.10 Aaronson RM，Gravcn KK, Tucc M, et a1. Non-neuronal enolase is an endothelial hypoxic stress protein J. J Biol Chem, 1995,

13、270(46): 27752-27757.11 Carneiro CR, Postol E, Nomizo R, et a1. IdentiFication of enolase as a laminin-binding protein on the surface of Staphylococcus aurcusJ. Microbes Infection , 2004 , 6 ( 6 ) ; 604-608.12 Bcrnal D,de la Rubia JE，Carrasco-Abad AM , et al.Identification of cnolxse as a plasminoge

14、n-binding protein in excretory-secretary products of Fxsciola hepxticaJ. FEBS Lett 2004, 563 (1-3): 203-206.致谢 本论文是在中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业部兽医公共卫生重点开放实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室完成。 值本论文完成之际，谨向中国农业科学院兰州兽医研究所张德林研究员表示衷心的感谢！在我两个半月的实习当中，张老师给予我莫大的关心和帮助，使我铭感终生。他严谨的治学态度、随和的处世心态、豁达的人生观，使我深受启迪并将终身受益，在此向他致以崇高的敬意和我最真挚的感谢! 衷心感谢甘肃农业大学生命科学技术学院刘霞教授在学习和生活中给予我的关怀和帮助！ 衷心感谢王萌、杨晓宇师姐及蒲元华师兄在试验中给予的帮助！ 衷心感谢甘肃农业大学这四年对我的培养！ 感谢我的父母在学习与生活中给予的极大的鼓励和无私的奉献，正是由于他们的付出，才使我的学业能够得以顺利完成。谢国华 2014年5月15日