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第二章检验技术基础知识

良好的实验室操作规范检验技术基本原则和要求样品的采集、制备与保存样品的前处理方法样品前处理新技术

本章小结良好的实验室操作规范GLP(goodlaboratorypractice)内容GLP的特点

GLP的含义GLP（GoodLaboratoryPractice），中文直译是良好实验室规范或标准实验室规范。GLP是就实验室实验研究的实施从计划、实验、监督、记录到实验报告等一系列管理而制定的法规性文件，涉及到实验室工作的可影响到结果和实验结果解释的所有方面。GLP内容概要

GLP规范的建设、实施和检查的全过程，可分为软件管理和硬件管理。一般将人员组织机构、实验方案、实验操作规程、记录档案等归于软件管理；而将实验设施，仪器、设备，特别重要的是实验动物的设施列入硬件管理。

GLP对硬件管理的要求

GLP对实验设施的要求：实验设施主要分为以下几个方面：动物实验设施，检测实验设施，样品和对照品的处理设施，档案及资料设施，设施的管理，废物处理设施。要求这些设施保持清洁卫生、布局合理、设计达标、配置适当、功能齐全、满足工作需要。GLP对硬件管理的要求GLP对仪器设备的要求：包括：一般毒理检测、药理学检测、病理学检查、遗传毒理检测、化学分析及毒代分析、大型设备；对仪器设备的购置、验收、安装、调试、管理、检定、使用、维护、维修全过程的严格管理、有规章制度、有标准、有检查监督、有记录。仪器设备的种类、数量、精度、量程、分辨率、参数应能满足毒性检测和药品安全评价研究工作的需要，并有必要的数据记录和处理仪器，备品、备件、附件和消耗品。GLP的人员管理

具备GLP意识、了解和熟悉GLP的基本内容、全面掌握并严格执行GLP的要求，具有相应的专业及文化程度、严谨的科学作风的职业道德，这是对所有GLP人员的总要求。GLP人员组成包括三类：实验室负责人、实验(研究)人员和质量保障部门的监督人员。

试验设施内的GLP组织系统标准操作(standardoperationprocedures，SOP)

实施GLP的重点，主要内容有：被检物及对照物的领取、标记、保管、处理、溶剂和混合抽样；设备及器材的维修管理；微生物菌种的保存，培养；试验的操作、测定、检查及分析；样本的取样及识别；数据资料的处理、保管及检索等。GLP的特点GLP能使实验工作有章可循、严密有序、相互衔接、紧密配合，保证实验数据和结论的科学性、可信性和重复性；标准操作规程是安全检测机构建设的重要组成部分，是保持实验过程有机联系、工作有序的运行规范，是安全检测机构内部的法规性文件；

GLP的特点强调软硬件结合，硬件需要领导重视和一定力度的经济投入，而软件则依靠科学管理和人员的素质，尤其强调软件的执行管理；

GLP可操作性强，简单明确，便于理解和掌握。取样溶样分离富集分析测定预处理消除干扰减小误差分析目的选择方法分析测定的过程检验技术的一般要求水及试剂的要求：方法中未注明其他要求时，均指蒸馏水或去离子水溶液未指明用何种试剂配制时，均指水溶液一般碱液和金属溶液用聚乙烯瓶存放；需避光的试剂存放在棕色瓶中，其他试剂存放在硬质玻璃的试剂瓶中根据分析任务、方法及结果准确度选择不同级别的试剂：

一级：优级纯、GR、保证试剂、用作基准物质

二级：分析纯、AR、检验常用试剂（除特别说明外）

三级：化学纯、CR、也用于常规分析中

四级：实验试剂、LR、纯度较低、分析检验中较少采用检验技术的一般要求检验方法的选择，以国家标准（GB）方法的第一法为仲裁方法；检验时必须做空白试验及平行试验；精密仪器：防震、防晒、防尘、温湿度符合要求、按规程操作工作结束：关水、电、气、门、窗

待检批量食品原始样品平均样品试验样品复验样品保留样品采样步骤检样：从整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样。原始样品：把许多检样混在一起为原始样品。平均样品：原始样品经处理再抽取其中一部分作分析用的称平均样品。检样采样数量和方法

液体、半流体饮食品粮食及固体食品肉类、鱼类、蔬菜类等组成不均匀的样品罐头、瓶装食品或其它小包装食品

检验样品的制备

采样后，采用下面方法制备：①用玻璃棒、电动搅拌器摇动或搅拌（液体、浆体或悬浮液样品）②振荡搅匀（固体样品）

③研磨或用捣碎机（对于带核、带骨头的样品，在制备前应该先去核、去骨、去皮）制备后为原始样品，采用四分法取样制为平均样品。检验样品的制备样品的前处理方法

前处理：即根据被测物质和杂质间性质上的差异，使用不同的分离方法，将被测物质同有干扰的杂质进行分离，然后再进行以后的测定。样品的前处理，是关系到检验成败的关键步骤。

样品前处理的目的

去除样品中的干扰物；浓缩痕量的被测组分,提高方法的灵敏度,降低最小检测极限；缩减样品的重量与体积,便于运输与保存；通过衍生化与其它反应使被测物转化为检测灵敏度更高的物质或与样品中干扰组分能分离的物质,提高方法的灵敏度与选择性；保护分析仪器及测试系统,以免影响仪器的性能与使用寿命。前处理方法应具备的条件

能最大限度地除去干扰被测组分的物质；被测组分的回收率高；

操作简便；成本低廉，避免使用昂贵的仪器、设备与试剂；不用或少用对环境及人体有影响的试剂,

尤其是卤代烃类的溶剂；

应用范围广；适用于野外或现场操作。样品前处理的传统方法

挥发法

沉淀法

蒸馏法

吸附法

透析法

提取法

有机质破坏法

沉淀法利用被测物质或者杂质能与试剂生成沉淀的反应，经过过滤等操作，使被测成分同杂质分离。铅盐沉淀法：经典方法之一，由于醋酸铅及碱式醋酸铅与多种成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，利用这种性质使有效成分与杂质分离。试剂沉淀法：溶液中加入某些试剂或改变溶液的pH值，使所需成分沉淀析出。提取法使用无机溶媒如水、稀酸、稀碱溶液，以及使用有机溶媒如乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、石油醚等，从样品中提取被测物质或除去干扰杂质的方法，分为浸取和萃取。分配定律：提取法萃取的效率

溶媒的选择：对被测物质有最大溶解度，而对杂质有最小溶解度的溶媒；两种液体分层的难易以及是否会产生泡沫等。萃取的方法：

多次萃取一次萃取显然，有机质破坏法

将有机质长时间高温处理，并加强氧化剂作用，使有机质分子彻底破坏，所含的碳、氢、氧元素生成CO2和H2O逸出，金属化合物中的金属部分生成了简单的无机金属离子化合物。应用于检验食品中微量金属离子及非金属离子，如硫、氮、氯、磷等。

样品前处理新技术微波萃取技术超临界流体萃取技术超声波萃取技术加速溶剂萃取技术膜分离技术固相萃取技术固相微萃取技术萃取技术色谱技术膜技术微波萃取技术微波萃取的定义微波萃取的原理微波萃取的特点微波萃取的应用微波萃取技术

微波萃取(MicroAmplitudeExtraction)，又称微波辅助提。侵甘褂檬屎系娜芗猎谖⒉ǚ从ζ髦写犹烊灰┯弥参、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。微波萃取技术的发展过程第一篇文献发表于1986年，R.N.Gedye等人将样品放置于家用微波炉，只需几分钟就可萃取传统加热需要几个小时甚至十几个小时的目标物质。90年代初，由加拿大环境保护部和加拿大CWT-TRAN公司携手开发了微波萃取系统(MicrowaveAssistedProcess,

MAP)后，该技术得到广泛应用。微波技术原理

微波是指波长在1mm至1m之间的电磁波，微波作用下，介质材料中的极性分子从原来的热运动状态转向依照电磁场的方向交变而排列取向,

产生类似摩擦热,使介质温度出现宏观上的升高。产生大功率的微波元件叫磁控管，它是1940年英国伯明翰大学的教授发明的。微波萃取的原理萃取的机理主要为两方面：

高频电磁波使植物细胞内部维管束和腺细胞吸收微波能，温度迅速上升，细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂，细胞内有效成分自由流出。微波所产生的电磁。铀俦惠腿〔糠殖煞窒蜉腿∪芗两缑胬┥⑺俾。微波萃取的特点

质量稳定，可有效地保护食品、药品中的有效成分,产品质量好；对萃取物具有高选择性，产率高；萃取快，省时(可节省50%～90%

的时间)；溶剂用量少(可较常规方法少50%～90%)，无污染,属于绿色工程；后处理方便；生产线组成简单,节省投资；低耗能。微波萃取与传统热萃取的区别

传统热萃取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行，称外加热；微波萃取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，称内加热；与外加热方式相比，内加热具有加热速度快、受热体系温度均匀等特点。微波萃取工艺流程

在中药有效成分提取中的应用用于食品色素的提取用于生物碱的提取用于多糖的提取用于黄酮的提取用于皂苷的提取用于挥发油的提取超临界流体萃取技术（SFE）超临界流体的发展超临界流体的含义及特性超临界流体的萃取剂及特点超临界流体技术的萃取流程超临界流体技术的应用及展望超临界流体的发展1822年，Cagniard首次报道物质的临界现象。1879年，HannyandHogarth发现了超临界流体对固体有溶解能力，为超临界流体的应用提供了依据。1970年，Zosel采用sc-CO2萃取技术从咖啡豆提取咖啡因，从此超临界流体的发展进入一个新阶段。1992年，Desimone首先报道了sc-CO2为溶剂，超临界聚合反应，得到分子量达27万的聚合物，开创了超临界CO2高分子合成的先河。超临界技术得到快速发生和广泛应用。超临界流体萃取技术之所以如此迅速发展，原因：①各国尤其是发达国家的政府对食品、药物等的溶剂残留、污染制定了严格的控制法规；②消费者日益担心食品生产中化学物质过多使用；③传统加工技术不能满足高纯优质产品的要求；④传统加工技术能耗大。发展迅速溶剂萃取超临界萃取溶剂残留不可避免完全无溶剂残留，纯净存在重金属无重金属溶剂的溶解能力为定值溶解能力随温度和压力变化可能使用高温，热敏物质分解通常在较低温度下，不分解存在无机盐被萃取的问题无无机盐残留溶剂选择性差选择性好需额外的操作单元来脱除溶解在线分离，有效物质收率高溶剂萃取和超临界萃取的对比超临界流体萃取技术——相关概念物质处于其临界温度(TC)和临界压力(TP)以上的单一相态，即超过气、液两相临界温度和临界压力时的非气、非液流体称超临界流体(Supercriticalfluid,SCF,SF)。在一定温度条件下，应用超临界流体作为萃取溶剂，利用程序升压对不同成分进行分步萃取的技术，称为超临界流体萃取技术。超临界流体萃取技术——原理A-Tp线气固平衡升华曲线B-Tp线液固平衡熔融曲线Tp-Cp线气液平衡蒸气压曲线Tp三相点Cp临界点超临界流体特征相密度(g/ml)扩散系数(cm2/s)粘度(g/cm.s)气体(G)10-310-110-4超临界流体（SFE）0.3～0.910-3～10-410-4～10-3液体(L)110-510-2常用的萃取剂物质沸点/℃临界点数据临界温Tc/℃临界压Pc/Mpa临界密度ρ/(g/cm3)二氧化碳－78.531.067.390.448水100374.222.000.344乙烷－88.032.44.890.203乙烯－103.79.55.070.20丙烷－44.5974.260.220丙烯－47.7924.670.23n–丁烷－0.5152.03.800.228n–戊烷36.5196.63.370.232n–己烷69.0234.22.970.234甲醇64.7240.57.990.272乙醇78.2243.46.380.276异丙醇82.5235.34.760.27苯80.1288.94.890.302甲苯110.63184.110.29氨－33.4132.311.280.24甲烷－164.0－83.04.60.16接近室温压力适中最高最适合CO2应用最多原因：

化学性质稳定，不易与溶质发生化学反应；无臭、无味、无毒、不会造成二次污染；

纯度高、价格适中，便于推广应用；沸点低，易于从萃取后的馏分中除去，后处理较为简单；萃取过程无需加热，适用于对热不稳定的化合物的萃取。超临界CO2的溶解能力

CO2对不同溶质的溶解能力有以下规律：亲脂性、低沸点成分可在低压萃。104kPa)，如挥发油、烃、酯等；化合物的极性集团愈多，就愈难萃。换衔锏姆肿恿坑，愈难萃。坏鹘谖露群脱沽，可具有与正己烷、氯仿、苯、四氯化碳、乙醚等多种有机溶剂相同的溶解度参数。SFE-CO2技术的优点

在接近室温(35-40℃)下进行提。行У胤乐沽巳让粜晕镏实难趸鸵萆ⅲ籗FE是最干净的提取方法，全过程不用有机溶剂；萃取和分离合二为一，效率高、能耗少，节约成本；CO2是一种不活泼的气体，价格便宜，纯度高；压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数；时间短

SCF具有很强的穿透能力和高溶解度，它能快速地将提取物从载体中萃取出。SFE-CO2技术的不足它的萃取对象多数仍局限于非极性或弱极性物质，对含有羟基、羧基等极性基团的物质则难以萃取或无法萃。欢杂谑称分械奶、氨基酸、蛋白质、核酸、纤维素等分子量较大的物质的分析，用SFE预处理样品也不甚理想。常规萃取流程实验室超临界CO2萃取过程SFE-CO2仪器的组成

SFE-CO2技术的应用

SFE技术近30多年来引起人们的极大兴趣，在化学反应和分离提纯领域开展了深入的研究。1988年在法国尼斯召开了第一届“国际超临界流体技术会议”以后，国际上每3年召开一次会议，进行国际间的学术交流。实验室设备工业化压缩机

萃取釜

制冷MVC-760L

二氧化碳循环泵

超临界CO2流体萃取设备（国外）1.德国伍德公司2.美国SupercriticalProcessingInc3.意大利Fedegari公司应用范围品种功能性油脂沙棘油、小麦胚芽油、鱼油、葡萄籽油、耐鹊油等中药及中药提取物穿心莲提取物、当归油、丹参提取物、厚朴提取物、薄荷油、五味子油、车前子油、柴胡油、川穹油、姜黄色素、菟丝子油、枸杞子油、鸦胆子油、天然咖啡因、紫草素、丹皮酚、乳香提取物、野菊花油、苍术油、我术油、香附油、青蒿素、霍香游、紫苏叶油、熊果酸调味品姜油、辣素、辣椒色素、花椒油、胡椒油香料、香精辛夷花精油、烟叶精油在分离提取中的应用超临界流体的发展前景

SCF技术作为一种“绿色工艺”,为正在兴起的“绿色化学”提供一个新的思路，将在高分子聚合、有机反应、酶催化反应、材料制备等方面得到广泛应用，前途是诱人的。德国、日本和美国已处于领先地位，工业化的大型SFE设备有5000L～10000L的规模，日本已成功研制出超临界色谱分析仪。超临界条件下的反应的研究成为重点，特别是超临界水和超临界二氧化碳条件下的各类反应。SFE应用的领域更为广泛，除了天然产物的提取、有机合成外，还有环境保护、材料加工、油漆印染、生物技术和医学等。超临界流体的发展前景超声提取技术——概念超声提取是利用超声波(频率>20KHz)具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，增大介质的穿透力以提取有效成分的技术。组织细胞变形植物蛋白变性生物分子解聚超声提取技术——原理(机械效应)超声波在介质中的传播可以使介质质点在其传播空间内产生振动，从而强化介质的扩散、传质，即超声波的机械效应。超声波

传播辐射压强分子摩擦微激波超声提取技术——原理(空化效应)介质内部溶解的微气泡在超声波的作用下增大，形成共振腔，然后瞬间闭合，即超声波的空化效应。微气泡超声波增大共振腔形成植物细胞破裂瞬间闭合成分

溶出介质及药材组织导

致超声提取技术——原理(热效应)超声波在传播过程中，声能不断被介质所吸收，并全部或大部分转化成热能，导致介质本身和药材组织温度升高，促使有效成分的溶解，这就是超声波的热效应。超声波

传播声能热能介质

吸收促

使温度升高超声提取技术——优点提取过程不需要加热适用于热敏物质节省能源提取过程为物理过程不影响有效成分的生理活性有效成分的提取率高溶剂用量少提取物有效成分含量高利于精制超声提取当前浸出提取中具有前途的提取技术超声提取技术——应用前景选择性提取替代现有的热水提和醇提超临界状态下的提取与膜技术结合的低温提取浓缩技术

加速溶剂萃取技术(AcceleratedSolventExtraction,ASE)是在较高的温度(50℃~200℃)和压力(1000~3000psi)下用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖的样品前处理方法。加速溶剂萃取技术——定义（Psi为英制压力单位，即磅力每平方英寸（1bf/in2）

1psi=6894.76pa）高温：增加待测物的溶解度；增加扩散速度；破坏溶质与基质之间的相互作用；降低溶剂的粘度(更好的穿透性)；降低表面张力(更好的润湿性)；高压：迫使溶剂进入基质内部ASE加速溶剂萃取技术——定义ASE加速溶剂萃取技术——工作流程原理：ASE原理与SFE相似，T<Tc，P<Pc，可以借用SFE的仪器，步骤与SFE类似，可采用静态、动态萃取等模式。优点：溶剂用量较少；萃取时间短（15min）；回收率、精度与索氏萃取相当;

非超临界状态，易控制。ASE加速溶剂萃取技术——原理与优势用于酸性、碱性和中性物质,有机氯和有机膦农药,氯代除草剂,多氯联苯类物质、二恶英、多氯二苯呋喃,总石油烃、柴油和废油等的萃取。加速溶剂萃取技术——应用Dionex公司的ASE?100、300型仪器ASE加速溶剂萃取技术——仪器膜分离技术——概述人类对于膜现象的研究源于1748年，然而认识到膜的功能并用于为人类服务，却经历了200多年的漫长过程。大致历程（20世纪）：

30年代：微孔过滤

40年代：透析

50年代：电渗析

60年代：反渗透

70年代：超滤和液膜

80年代：气体分离

90年代：渗透汽化

1.膜的概念分离是利用薄膜对混合物组分的选择性透过性能使混合物分离的过程。在一个流动相内或两个流体相机之间有一薄层凝聚相物质把流体相分割开来成为两部分，这一凝聚相物质就是膜。膜至少具有两个界面，膜通过这两个界面分别与被膜分开于两侧的流体物质互相接触，膜可以是完全透过性的，也可以是半透过性的，但不应是完全不透过性的。食品高新技术——第四章食品分离技术膜的显微照片2.膜分离概念用天然或人工合成的高分子薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和浓缩的方法，统称为膜分离法。膜分离技术根据过程推动力的不同，大体分为两类：一类是以压力为推动力的膜过程，在工业中具有突出实用意义的是超滤和反渗透；另一类是以电力为推动力的膜过程，所用的是一种特殊的半透膜，称为离子交换膜，电渗析就是这种具有工业实用意义的电膜过程。膜分离过程原理：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。膜上游透膜膜下游平板膜组件管式膜组件3.分离膜的分类对于固体合成膜可分成两大类：（1）对称膜

I.致密膜

II.多孔膜（2）非对称膜

I.相转化膜

II.复合膜对称膜

对称膜膜截面方向（即渗透方向）的结构都是均匀的，其厚度在10-200?m之间，传质阻力由膜的总厚度决定，降低膜的厚度可以提高渗透速率。对称膜的制备方法很多，其中化学提取和粉末烧结主要用于无机膜的制造。非对称膜

膜截面方向结构是非对称的，其表面为极薄的厚度为0.1-0.5?m起分离作用的致密表皮层，或具有一定孔径的细孔表皮层，皮层下面是多孔支撑层（厚度为50-150?m）。它结合了致密膜的高选择性和薄膜的高渗透速率的优点，传质阻力主要或完全由很薄的皮层决定。非对称膜非对称膜醋酸纤维素膜的结构示意图99％表皮层，孔径（8－10）×10－10m过渡层，孔径200×10－10m多孔层，孔径（1000－4000）×10－10m1%试验用膜分离系统试验用膜分离系统与传统分离相比,膜分离具有以下优点：1.没有相变化，不需要液体沸腾；也不需要气体液化，不需要投加化学物质，是低能耗、低成本的分离技术2.分离过程在常温下进行，特别适用于热敏感物质如:蛋白质、酶、药品的分离、分级、浓缩和富集有独特的优点；分离浓缩同时进行，能回收有价值的物质；3.应用范围广,对无机物、有机物及生物制品都可适用,还适用于许多特殊溶液体系的分离,如:溶液中大分子与无机盐的分离、一些共沸物及近沸点物系的分离等4.膜分离装置简单、操作容易、制造方便，应用范围广，不产生二次污染；易于实现自动化。在食品工业中的应用膜分离技术在食品中的应用占其工业应用总数的68%，其中乳品工业占37%，果汁加工业占18%，海水淡化占8%。其它如在果蔬汁加工、在乳制品加工、在粮油加工、在酿造工业、在制糖工业、在酶制剂工业、在食品加工废弃物处理等领域有广泛应用与食品工业中传统方法相比，膜技术具有显著的优越性：1.保持色、香、味及营养成分2.节能3.应用范围广4.简化流程和操作本章小结良好的实验室操作规范一节中，要求掌握GLP的含义，GLP内容中的软件管理和硬件管理分别是什么，GLP有哪些特点，熟悉GLP对硬件管理的要求，了解我国GLP的情况，GLP的人员组成，GLP中标准操作规程的内容。掌握检验技术的基本原则，熟悉检测技术操作的基本要求。样品的采集、制备与保存一节中，要求掌握采样要求、样品的制备方法，熟悉采样数量和方法，样品的保存方法。本章小结样品的前处理方法一节中，要求掌握样品前处理的目的，传统的几种前处理方法，重点掌握沉淀法和提取法，熟悉一个好的前处理方法需具备的条件。微波萃取技术一节中，要求掌握微波萃取的定义及萃取原理、微波萃取的特点，熟悉微波萃取与传统热萃取的区别，了解微波萃取有哪些应用。本章小结超临界流体萃取技术一节中，要求掌握超临界流体的含义、主要特性及萃取原理、超临界流体萃取的特点，熟悉超临界流体的萃取流程，了解超临界流体萃取技术的应用及发展前景。超声波萃取、加速溶剂萃取、膜分离技术要求掌握定义与分离原理。本章重点为样品的前处理方法及前处理新技术。