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环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应实验kok电子竞技孙晓川生142011011983一、实验目的:1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。

2.了解紫外线诱变原理,并初步掌握紫外线诱变育种的方法。

3.练习单菌落划线分离微生物。

二、实验原理:在自然界中,微生物分布极其广泛,几乎无处不在,微生物的生长发育受着环境因素的影响。

而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同,有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件,有的表现为抑制作用,有的表现为杀菌作用。

1.温度对微生物的影响:温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度,但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素,菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。

2.化学因素对微生物的影响:常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。根据是杀死还是抑制微生物,可分为致死剂和抑制剂。常用的3个指标:最低抑制浓度(MIC)、半致死剂量和最低致死剂量。

3.生物因素对微生物的影响:许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素,具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。不同抗生素的抗菌谱是不同的,某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。青霉素主要抗G+细菌。链霉素作用于核糖核酸30S亚基,所以链霉素只作用原核生物。链霉素以抗G-细菌为主。

4.紫外线的对微生物的影响:4.1紫外线杀菌:紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构,使其不能正常行使功能。另外,空气在紫外线照射下产生臭氧(O3),也有一定杀菌作用。紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。紫外线透过物质能力很差,所以只适用于空气及物体表面的灭菌,它距离照射物以不超过1.2米为宜。紫外线对于人体也有伤害作用。

4.2紫外线诱变:紫外线对细菌生长的影响是随着紫外线对微生物照射剂量、时间及距离的不同,对微生物的生理活动也相应地产生不同的效果:剂量高、时间长、距离短就易杀死它们,剂量低、时间短、距离长时就会有少量个体残存下来,其中一些个体的遗传特性发生了变异。

我们可以利用这种特性来进行灭菌或菌种选育工作。紫外诱变最有效的波长仅仅是在253~265nm,一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。

三、实验仪器、材料和用具:紫外照射箱,37℃培养箱、34℃培养箱、30℃培养箱、25℃培养箱

24个淀粉培养基平板

在一边已长成一直线状菌落的产黄青霉,链霉菌平板各1个

培养18小时的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌菌液、粘质赛氏杆菌的平板

无菌的小圆滤纸片、接种环、黑纸、标签纸、酒精灯、记号笔、试管架

0.05%甲紫,5%苯酚,1/200稀释的84消毒液,1/500甲醛,75%乙醇,95%乙醇,1%过氧化氢,2.5%碘酊四、实验步骤:(一)温度对微生物生长的影响:1.用接种环取培养好的粘质赛氏杆菌单菌落,在三个肉汤蛋白胨平板上分区划线接种,要保证能得到单一菌落。2.做好标记,将第一个平板在25℃,第二个在30℃进行培养,第三个在37℃进行培养。24h后取出,观察不同温度下培养粘质赛氏杆菌生长状况和产生色素情况。3.对未知菌S3进行相同操作,最后分别放在30℃、34℃、37℃的培养箱中进行培养。(二)化学因素对微生物生长的影响:1.用无菌吸头吸取100μl培养18h的金黄色葡萄球菌菌液于肉汤蛋白胨培养基上,用无菌涂布棒涂布均匀。

2.将上述培养皿用记号笔分成八等份,每一等份内标明一种药物名称。

3.用无菌镊子将小滤纸片分别浸入各种药剂中,然后对号放入培养皿的小区内(注意不要造成药品交叉污染)。4.置37℃温室培养24h后,观察。比较抑菌圈大小。

(三)生物因素对微生物生长的影响:1.用肉汤蛋白胨培养基制成平板,在平板一侧,用接种环取产黄青霉的孢子,在平板上划一直线接种,置于28℃培养48~72h。(助教完成)

2.待形成菌苔后,从距产黄青霉的菌苔边缘5mm处用接种环并分别垂直向外划直线接种已培养18小时的大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。在37℃培养24h,观察结果。注意所取菌的量不要太大。

3.用同样的方法做泾阳链霉菌的抗菌谱试验。(四)紫外线的对微生物的影响:1.用无菌吸头吸取100μ1培养18h的金黄色葡萄球菌液于肉汤蛋白胨培养基平板上,用无菌涂棒涂布均匀。

2.用一张三角形或任意形状的报纸条遮住部分平板培养基,打开皿盖,置紫外灯下照射3min后取出报纸,盖上皿盖。

3.在黑暗中(或红灯下)用双层报纸包裹,倒置于37℃培养24h后观察结果。

(五)紫外线对微生物的诱变效应:1.取摇瓶培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液0.1ml加入0.9ml生理盐水中,进行10倍稀释,依次做10-1~10-8稀释。

2.涂布:取各100μl菌液涂平板,每个稀释度涂平板2只。

3.紫外线(30W,30cm)处理:10-5照射20s,10-4照射30s,10-3照射40s、10-2照射50s,10-1照射60s。以10-6,10-7和10-8平板作对照。处理后的培养皿在黑暗中(或红灯下)用双层报纸纸包好,倒置37℃培养,24h后观察并记录结果。五、实验结果及分析:(一)温度对微生物的影响:1)温度对粘质赛氏杆菌的影响:培养温度/℃253037实验现象微红较25℃更红一些无色结论:粘质赛氏杆菌在30℃左右生长情况最好。图1:25℃粘质赛氏杆菌生长情况图2:30℃粘质赛氏杆菌生长情况图3:37℃粘质赛氏杆菌生长情况2)温度对未知菌S3的影响:培养温度/℃303437单菌落直径/cm1.01.62.1结论:未知菌S3在37℃或以上生长情况最好。图4:30℃未知菌S3生长情况图5:34℃未知菌S3生长情况图6:37℃未知菌S3生长情况(二)化学试剂的抑菌现象:化学试剂抑菌圈半径(mm)2.5%碘酊1275%乙醇未出现透明圈5%苯酚111/200稀释的84消毒液101%甲醛溶液110.05%甲紫50.595%乙醇17H2O211抑菌能力:0.05%甲紫的抑菌能力最强,其次是95%乙醇溶液,剩余的5种溶液(不含75%乙醇)抑菌效果相差不多。图7:不同化学试剂对金黄色葡萄球菌生长的抑制(三)生物因素对微生物生长的影响:1)产黄青霉的抑菌作用:图8:青霉素的抑菌效果结论:产黄青霉产生的青霉素对金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制作用,而对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌则抑制效果不明显。2)泾阳链霉菌的抑菌作用:图9:链霉素的抑菌效果结论:泾阳链霉菌产生的链霉素对大肠杆菌的生长有明显的抑制作用,而对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌则抑制效果不明显。(四)紫外线对微生物的诱变效应:稀释度照射时间(s)处理后的活菌数平均值(30~300)存活率(%)致死率(%)1210-160无法计数120120几乎为0几乎为10010-250无法计数2424几乎为0几乎为10010-340250无法计数2500.0299.9810-43001260.00599.99510-5200420.0299.9810-6030604510-7047244710-8006030由10-6、10-7和10-8的结果,估算出未稀释时,100μl溶液中大概有1.2×109个。可依此来推算存活率和致死率。图10:稀释10倍的枯草芽孢杆菌在紫外线下照射60s后的生长情况图11:稀释102倍的枯草芽孢杆菌在紫外线下照射50s后的生长情况图12:稀释103倍的枯草芽孢杆菌在紫外线下照射40s后的生长情况图13:稀释104倍的枯草芽孢杆菌在紫外线下照射30s后的生长情况图14:稀释105倍的枯草芽孢杆菌在紫外线下照射20s后的生长情况图15:稀释106倍的枯草芽孢杆菌的生长情况图16:稀释107倍的枯草芽孢杆菌的生长情况图17:稀释108倍的枯草芽孢杆菌的生长情况图18:观察透明圈直径与菌落直径的比值。左为实验组,右为对照组。左图比值约为2,右图比值约为1.5,说明紫外线有一定的诱变作用。(五)紫外线杀菌效果的观察:图19:紫外线杀菌效果的观察遮光部分细菌生长的更好,说明紫外线有一定的杀菌效果。六、讨论:1.温度对粘质赛氏杆菌生长的影响实验中,30℃和25℃实验条件下的菌落颜色只有细微差别。其原因可能有两个:一是接种时两个板的接种量不同,25℃原细菌数要多一些;二是培养时间较短,细菌色素积累量没有达到可以区分的量。因此可以延长细胞培养时间来进一步确定粘质赛氏杆菌生长的最适温度。2.推测各化学物质的抑菌能力时,75%乙醇的实验组中并未出现透明圈,然而这并不能说明乙醇没有抑菌能力。乙醇挥发性很强,很可能在实验中迅速挥发掉了,所以没有起到抑菌作用。从这个实验中我们也可以看出,紫药水的消毒能力是很强的,因此平时生活中,如果出现小的伤口,用紫药水消毒是一个不错的选择。3.从生物因素对微生物生长影响的实验中可以看出,链霉素和青霉素的抗菌谱基本上是互补的。青霉素抗菌谱主要是革兰氏阳性菌和部分阴性菌而链霉素则相反。4.紫外诱变实验中,可用数据量很。笛槲蟛詈艽,因此得不到准确的结果。对照组中的菌落的HC值大约为1。5,而诱变组出现了HC值大于2的菌落,说明紫外线的诱变效果还是比较明显的。理论上突变率和照射时间正相关。在诱变时需要把握致死率和突变率的平衡点,即掌握好紫外线照射时间。过长则细菌存活量少,过短则突变率低。5.未知菌S3的鉴定。通过几次试验,我们测出未知菌S3为革兰氏阴性菌,最适生长温度在37℃左右,其生理生化反应情况如下表:反应葡萄糖发酵实验乳糖发酵实验甲基红实验伏-普实验吲哚实验硫化氢实验明胶液化实验淀粉水解实验柠檬酸盐利用实验结果阳性阳性阴性阳性阴性阳性阳性阳性阴性由伯杰氏细菌鉴定手册可推测未知菌S3可能是固氮菌属,也可能是氮单胞菌属。若想进一步确定该菌菌种,可以用显微镜观察该菌细胞的大小、形状等特性,还应该多做一些生理生化反应,缩小检索范围。七、参考文献:[1]陈金春,陈国强等,微生物学实验指导,清华大学出kok电子竞技社,2005

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