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分子遗传学复制详解演示文稿目前一页\总数六十页\编于二十点优选分子遗传学复制目前二页\总数六十页\编于二十点双螺旋模型的提出,预示了DNA的半保留复制机制。对于DNA复制,必须了解其起始、过程、终止、酶学、类型和单位。目前三页\总数六十页\编于二十点第一节复制原点、方向、方式和基本单位目前四页\总数六十页\编于二十点一、复制原点
DNA复制必须在特定的位置开始,这样的位置称为复制原点。大肠杆菌只有一个复制原点(oriC),它包含4个dnaA盒:dnaA蛋白结合的位点1个富含A/T区:呼吸作用强烈的区段真核生物染色体具有许多复制原点,它们都有一个富含A-T的自动复制序列(ARS)元件,其共有序列为:(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。被原点识别复合体(ORC)所识别。目前五页\总数六十页\编于二十点大肠杆菌的复制原点序列目前六页\总数六十页\编于二十点二、复制方向
DNA复制的方向是指复制叉移动的方向。复制叉复制眼复制方向有3种方式:双向复制(多数情况)单向复制不对称双向复制复制起点环状DNA双向复制形成的结构目前七页\总数六十页\编于二十点大肠杆菌DNA复制的电镜照片电镜照片的模式图目前八页\总数六十页\编于二十点对于环状DNA,不论是双向复制,还是单向复制,都会形成结构。可以用放射性标记法来观察鉴别复制方向:双向复制:两个复制叉都有放射活性单向复制:仅一个复制叉有放射活性双向复制一般等速进行,最终两个复制叉在与原点相对的位置相遇而使复制结束。单向复制的终点就是复制原点。目前九页\总数六十页\编于二十点大肠杆菌有促使复制终止的序列,称为ter位点,长度约23bp。已发现两个终止区,位于交汇点两侧约100bp处。目前十页\总数六十页\编于二十点在双向复制中,当两个复制叉因故不等速时,ter位点会迫使较快的复制叉停顿下来,等待较慢的复制叉,从而保证复制在终止区内结束。每条单链的ter位点都结合上ter结合蛋白,从而阻止复制叉的通过。目前十一页\总数六十页\编于二十点大肠杆菌DNA复制的整个过程目前十二页\总数六十页\编于二十点真核生物的复制都是双向的,且没有固定的复制终点。目前十三页\总数六十页\编于二十点通常复制原点是位于两条链的同一处,因而两条链的复制是对称的。但哺乳动物线粒体DNA的两条链的复制原点的位置不同,因而两条链复制起始的位置和时间不同,造成不对称双向复制。重链(H)轻链(L)重链复制原点轻链复制原点取代环(D环)目前十四页\总数六十页\编于二十点目前十五页\总数六十页\编于二十点目前十六页\总数六十页\编于二十点三、复制方式
DNA复制有两种方式:
复制叉式复制:即在复制原点形成复制叉,其新链合成所需的引物是新合成的,故称为从新开始。这是最常见的复制方式。滚环式复制:环状DNA采取的一种复制方式。其新链合成无须合成引物,而是利用一条亲链切断后产生的3端,由此不断延伸,合成出新链,故称为共价延伸。新合成的链不断从环中甩出,样子犹如滚环。目前十七页\总数六十页\编于二十点复制原点因负超螺旋而松缠,形成单链区,A蛋白切断正链,并结合到5端上。以自由3端为引物,以负链为模板合成新链,并将正链置换出来。复制叉回到复制原点后,A蛋白切断正链,结合到新的5端上,开始新一轮复制,释放出的正链可作为模板合成负链。噬菌体X174的复制模式目前十八页\总数六十页\编于二十点目前十九页\总数六十页\编于二十点
许多噬菌体都采用滚环式复制。某些真核生物的卵母细胞中采用滚环式复制来扩增rDNA(即rRNA基因),以满足大量合成蛋白质的需要。rDNA的每个重复单位先形成环状DNA,然后开始复制。目前二十页\总数六十页\编于二十点四、复制单位
DNA复制是以复制子(replicon)为单位进行的。每个复制子应包含一个复制原点,还可能包含一个复制终点。在每个细胞周期中,一个复制子只能被激活一次。一个原核生物的基因组就是一个复制子。每条真核生物的染色体包含许多复制子,相邻复制原点间的平均距离就是复制子的平均长度。真核生物的复制子较短,且复制速度较慢。目前二十一页\总数六十页\编于二十点几种生物复制子的数量、长度、复制速度目前二十二页\总数六十页\编于二十点第二节DNA复制有关的酶目前二十三页\总数六十页\编于二十点DNA复制主要涉及到5种酶DNA聚合酶DNA连接酶解旋酶(螺旋酶)旋转酶(拓扑异构酶II)引发酶目前二十四页\总数六十页\编于二十点一、DNA聚合酶
指能够利用DNA模板合成DNA新链的酶,其中只有某些负责DNA的复制,又特称为复制酶。大肠杆菌中有3种DNA聚合酶,分别记为polI、polII和polIII,其中polI和polII主要在DNA修复中发挥作用,polIII才是复制酶。目前二十五页\总数六十页\编于二十点DNA聚合酶有6个结合位点:(1)模板结合位点;(2)引物结合位点;(3)引物3‘-OH结合位点;(4)底物dNTP结合位点;(5)5‘→3’外切酶结合位点;(6)3'→5'校正位点。
目前二十六页\总数六十页\编于二十点DNA聚合酶以dNTP(N=A、T、G、C)为底物,根据模板链和碱基配对规则,催化正确的核苷酸的5位与正在合成的链的3端产生磷酸二酯键。目前二十七页\总数六十页\编于二十点DNA聚合酶催化DNA的合成必须提供3位的自由OH基,亦即需要一个引物。DNA聚合酶催化DNA的合成(亦即新链的延伸)只能朝53的方向。目前二十八页\总数六十页\编于二十点DNA聚合酶除了聚合功能外,还具有35外切酶活性。目前二十九页\总数六十页\编于二十点DNA聚合酶具有一种校对功能。考虑碱基配对互作,错配率预期为10-3,而细菌中实际为10-8~10-10。这主要归功于校对功能。目前三十页\总数六十页\编于二十点polI有很强的缺口(即DNA单链区)填补功能,可以对因DNA复制或损伤产生的缺口进行填补,但最后会留下一个切刻(即填补的最后一个核苷酸的3位的OH不能与其后面原来存在的核苷酸的5位的磷酸根产生酯键)。
polI(又称Klenow)还具有内切酶和53外切酶活性,能产生切刻平移。该功能可用来对DNA进行放射性标记。目前三十一页\总数六十页\编于二十点目前三十二页\总数六十页\编于二十点哺乳动物中名称与细菌的类比polIpolIIIpolII细胞中位置细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体功能复制修复复制修复复制真核生物中的DNA聚合酶目前三十三页\总数六十页\编于二十点二、其它有关的酶
名称功能DNA连接酶共价连接切刻(产生磷酸二酯键),将两条不连续的单链连成整体。解旋酶解开双链,使复制叉向前移动。旋转酶产生负超螺旋,使双链松缠,并消除复制叉移动时产生的正超螺旋。引发酶合成RNA引物。目前三十四页\总数六十页\编于二十点第三节复制起始和过程目前三十五页\总数六十页\编于二十点一、复制起始
以大肠杆菌为例第一步:在HU和IHF蛋白的协助下,DnaA蛋白与复制原点上的4个dnaA盒结合,使富含A/T区解开,暴露出两条单链。目前三十六页\总数六十页\编于二十点第二步:在DnaA和DnaC蛋白的辅助下,DnaB蛋白(解旋酶)进入单链区,并按53方向移动。目前三十七页\总数六十页\编于二十点第三步:随着解旋酶的移动,单链区逐渐扩大,引发酶和单链结合蛋白(SSB)遂与单链结合,这标志着复制已经启动。目前三十八页\总数六十页\编于二十点目前三十九页\总数六十页\编于二十点二、复制过程
解旋酶打破氢键,在复制叉处解开双链,SSB随之结合到亲本单链上,防止单链恢复成双链。拓扑异构酶(旋转酶)位于解旋酶前方,消除由双链解开而造成的正超螺旋。引发酶合成RNA引物,polIII随之合成新链。
polI切除RNA引物,并将缺口填上。DNA连接酶将新合成的DNA链片段共价连接起来。注意:先导链是连续合成的,而后随链则需在暴露出一定长度的单链后沿相反方向合成,因而是间断的。因此DNA合成是半连续的。目前四十页\总数六十页\编于二十点DNA复制过程图解目前四十一页\总数六十页\编于二十点第四节线形DNA末端的复制问题目前四十二页\总数六十页\编于二十点由于所有的DNA聚合酶都只能催化53方向的合成,因而造成线形DNA末端的复制问题。目前四十三页\总数六十页\编于二十点目前四十四页\总数六十页\编于二十点不同的生物有不同的解决办法:
办法一:将线形DNA环化。如:噬菌体。
办法二:几个线形DNA分子首尾连接形成多聚体(连环)分子。如:T7噬菌体。办法三:利用特殊的蛋白质从末端终止位点起始复制。如:腺病毒,噬菌体29。办法四:利用可变末端。如:真核生物中的端粒结构。目前四十五页\总数六十页\编于二十点末端蛋白大小为55kD,它通过丝氨酸残基与DNA5端上的自由磷酸根共价结合目前四十六页\总数六十页\编于二十点末端蛋白还能与DNA聚合酶结合,并携带一个胞嘧啶作为复制起始的引物目前四十七页\总数六十页\编于二十点腺病毒依赖一种末端蛋白可以从平头末端开始复制先对一条链进行复制,新链取代旧链使之释放出来。被取代出来的单链两末端具有互补性,可以自配对形成双链末端,于是复制可以启动。目前四十八页\总数六十页\编于二十点真核染色体的端粒是一段由很短的重复单位组成的串联重复序列,并存在一个单链的3末端。目前四十九页\总数六十页\编于二十点不同生物的端粒序列有一定的差异目前五十页\总数六十页\编于二十点端粒的总体长度是受遗传控制的。DNA复制时,端粒序列会缩短,但通过端粒酶,可以使端粒伸长,从而达到一种动态平衡。端粒酶是一种核酸蛋白复合体,含有RNA,可以作为合成端粒一条链的模板。因此,端粒酶是一种反转录酶。目前五十一页\总数六十页\编于二十点四膜虫端粒的合成目前五十二页\总数六十页\编于二十点目前五十三页\总数六十页\编于二十点目前五十四页\总数六十页\编于二十点第五节真核生物核小体的复制目前五十五页\总数六十页\编于二十点复制中双链解开时,核小体即解体。但双链一旦合成,即组装新的核小体。新核小体中的组蛋白是随机组装的,既包含旧的,也包含新合成的。目前五十六页\总数六十页\编于二十点实验证据先将细胞培养在含重氨基酸的条件下产生重组蛋白。然后将细胞培养在含轻氨基酸的条件下进行DNA复制。培养一段时间后,提取核小体八聚体,进行梯度离心,预计可能有两种结果:结果一:如果核小体不是重新组装的,则将出现两个分离的带区,重的(下面)带区为旧的核小体,轻的(上面)带区为新的核小体。结果二:如果核小体是重新组装的,则出现一个宽的连续变化的带区,中间部分较多。实验得到的是第二种结果。目前五十七页\总数六十页\编于二十点第六节DNA复制的调控目前五十八页\总数六十页\编于二十点一、原核生物DNA复制的调控—与细胞周期的协调
存在两种机制DnaA蛋白的浓度
DNA甲基化目前五十九页\总数六十页\编于二十点DnaA蛋白浓度的调控作用复制结束后,细胞中DNA含量增加了一倍;而细胞分裂后,部分DnaA蛋白可能黏附在细胞膜上。因此,从复制结束到细胞分裂结束一段时间内,没有足够的DnaA蛋白来启动新的一轮复制。目前六十页\总数六十页\编于二十点
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