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微生物检验技术基础知识微生物检验技术基础知识第1页目录一、微生物基础介绍二、培养基三、菌种四、微生物程度检验法微生物检验技术基础知识第2页一、微生物基础介绍1、微生物定义微生物是一些形体微。缘ハ赴蚣虻ザ嘞赴、甚至是没有细胞结构形式存在低等生物统称。2、微生物分类微生物主要分类单位：域、界、门、纲、目、科、属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系）“种”是最本分类单位，例：大肠埃希菌微生物检验技术基础知识第3页一、微生物基础介绍3、微生物特点体形微。唤峁辜虻ィ簧し敝晨欤恢掷喾倍，分布广，适应性强。包含：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体、支原体和病毒等。微生物检验技术基础知识第4页一、微生物基础介绍4、微生物形态结构4.1细菌4.2真菌（包含酵母菌和霉菌）微生物检验技术基础知识第5页一、微生物基础介绍5、微生物与咱们每张人民币带细菌：900万个；人体体表及体内存在大量微生物；皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；口腔“细菌种类超出500种；肠道：微生物总量达100万亿；微生物检验技术基础知识第6页一、微生物基础介绍

（未清洗手）

（凉水洗手）

（洗洁精洗后手）

（洗洁精洗后，消毒剂消毒手）微生物检验技术基础知识第7页二、培养基1、培养基制备培养基配制：

按处方配制，使用按处方生产符合要求脱水培养基微生物检验技术基础知识第8页二、培养基配制时注意：不得使用结块或颜色发生改变脱水培养基；常见溶剂是纯化水、蒸馏水，防止使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌；加热助溶，注意不要过分加热；如需要添加其它组分，加入后应充分混匀；配制用容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器；配制培养基普通要在1小时内完成，假如室温高，配制时间过长，易使培养基受污染；微生物检验技术基础知识第9页二、培养基2、培养基灭菌已配制好培养基最好尽快灭菌；普通培养基采取湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是121℃15分钟；湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌；高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形成死角。要定时对压力表等进行检定，检定周期普通为六个月；定时对灭菌效果进行检验，可采取生物指示菌法、化学变色纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证。微生物检验技术基础知识第10页二、培养基3、培养基贮藏贮藏注意：灭菌后培养基应快速取出，防止长时间保留在灭菌锅内，造成过分灭菌；培养基保留前应标上名称和制备日期（或到期日期）；琼脂培养基不得在0℃或0℃以下存放；琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保留，不超出一周；微生物检验技术基础知识第11页二、培养基4、培养再融化方式水浴加热微波炉注意：固体培养基灭菌后再融化只允许一次融化培养基应置于45℃～50℃水浴中，不得超出8小时微生物检验技术基础知识第12页二、培养基5、培养基性能评定全部购回、配制好培养基均应进行质量控制试验（培养基适应性检验）理化指标（P55）微生物学指标（P55）微生物检验技术基础知识第13页三、菌种1、分类（概念）：标

准

菌

株由我国或国际菌种保藏机构保藏标准贮备菌株由标准菌株经一次传代得到培养物商业派生菌株由供给商提供全部特征与标准菌株等效菌株工

作

菌

株由标准贮备菌株以传代得到培养物微生物检验技术基础知识第14页三、菌种注意：标准贮备菌株、工作菌株都应进行纯度和特征确认工作菌株传代次数不得超出5代（从菌种收藏机构取得标准菌株为第0代）“1代”是指将活培养物接种到微生物生长新鲜培养基中培养。试验室必须建立和保留其全部菌种进出、搜集、贮藏、保留、确认试验及销毁统计。微生物检验技术基础知识第15页三、菌种标准菌株：①冻干粉（图P63）②甘油冻存管（图P64）微生物检验技术基础知识第16页三、菌种菌种保藏机构：CMCC中国医学微生物菌种保藏管理中心GIMCC广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心ATCC美国经典菌种保藏中心例：

CMCC

（B）

26003菌种保藏机构

细菌

菌种编号（金黄葡萄球菌）微生物检验技术基础知识第17页三、菌种2、菌种判定

金黄色葡萄菌CMCC(B)26003甘露醇平板上划线分纯，经典菌落

为黄色圆形突起，表面湿润光滑；革兰氏染色：阳性，球菌。血浆凝固霉酶试验：阳性微生物检验技术基础知识第18页三、菌种铜绿假单胞菌CMCC(B)10104溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，经典菌落呈扁平，无定形、周围扩散，表面湿——灰白色，周围有蓝绿色素扩散。氧化酶试验：阳性绿脓菌素：阳性革兰氏染色：阴性，杆菌；微生物检验技术基础知识第19页三、菌种白色念珠菌CMCC(B)98001沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，经典菌落乳白色，表面光滑有浓酵母气味。革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。芽管试验：阳性微生物检验技术基础知识第20页三、菌种3、菌种保藏A：甘油冷冻管保藏法保藏温度：－30℃～80℃；保藏菌种使用期：1～2年优点：保留期较长，重复传代造成菌种变异风险较。蝗钡：操作相对复杂，成本较高。B：斜面低温保藏法保藏温度4℃左右，保藏时间1～3个月，但铜绿假单胞菌不宜用本法保留。优点：操作简便，成本低，比较轻易掌握；缺点：保留期比较短，重复传代有引发变异可能。。

保藏温度保藏使用期优点缺点甘油冷冻管保藏法-30℃～80℃1～2年·保留期较长，·重复传代造成菌种变异风险较小·操作相对复杂，·成本较高斜面低温保藏法4℃左右1～3个月·操作简便，·成本低，·比较轻易掌握·保留期比较短，·重复传代有引起变异可能；·铜绿假单胞菌不宜用本法保留。微生物检验技术基础知识第21页三、菌种4、菌种使用和销毁过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃30分钟生物灭活处理。微生物检验技术基础知识第22页四、微生物程度检验法1、定义微生物程度检验法—系检验非要求灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度方法。2、检验项目定量检验—细菌数、霉菌及酵母菌数定性检验—控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌）检验环境：与无菌检验相同微生物检验技术基础知识第23页四、微生物程度检验法3、检验量指一次检验用量；10g或10ml，膜剂为100cm2，珍贵药品、微量包装药品检验量能够酌减。4、供试液制备依据供试品理化特征与生物特征，采取适宜方法制备供试液；供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超出45℃。微生物检验技术基础知识第24页四、微生物程度检验法制备标准：简便、快速！供试液从制备至加入检验用培养基，不得超出1小时。微生物检验技术基础知识第25页四、微生物程度检验法供试品分类液体供试品固体、半固体或黏稠性供试品需用特殊供试液制备方法供试品非水溶性供试品膜剂供试品肠溶及结肠制剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品贴膏剂供试品具抑菌活性供试品：培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法

微生物检验技术基础知识第26页四、微生物程度检验法5、方法验证5.1验证菌株大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5.2计数方法验证当建立产品微生物程度检验法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证，以确认所采取方法适合于该产品细菌、霉菌及酵母菌数测定。若产品组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时，计数方法应重新验证。微生物检验技术基础知识第27页四、微生物程度检验法⑴试验组薄膜过滤法计数时：取要求量供试液，过滤，冲洗，在最终一次冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。⑵菌液组测定所加试验菌数（50～100cfu）⑶供试品对照组取要求量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数⑷稀释对照组用对应稀释液替换供试品，加入50～100cfu试验菌，按试验组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。微生物检验技术基础知识第28页四、微生物程度检验法验证方法：验证试验最少应进行3次独立平行试验，并分别计算试验菌每次试验回收率不低于70%，若任一次试验中试验组菌回收低于70%，应采取适宜方法消除供试品抑菌活性，并重新进行进行方法验证。微生物检验技术基础知识第29页四、微生物程度检验法5.3控制菌检验法验证当建立药品微生物程度检验法时，应进行控制菌检验方法验证，以确认所采取方法适合于该药品控制菌检验。采取薄膜过滤法时，取要求量供试液，过滤，冲洗，试验菌（10～100cfu）应加在最终一次冲洗液中，依法操作。若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检验法进行供试品该控制菌检验；若试验组未检出试验菌，应采取对应方法消除供试品抑菌活性，并重新进行方法验证。微生物检验技术基础知识第30页四、微生物程度检验法5.4细菌、霉菌及酵母菌检验检验方法：平皿法和薄膜过滤法按已验证计数方法进行供试品细菌、霉菌及酵母菌菌数检验微生物检验技术基础知识第31页四、微生物程度检验法菌落汇报规则：细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu；霉菌宜选取平均菌落小于100cfu稀释级，作为菌数汇报（即两位有效数字）依据。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平板有菌落，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数值汇报菌数。微生物检验技术基础知识第32页四、微生物程度检验法菌落汇报规则示例各稀释级（供试液1ml/皿）平均菌落计数（cfu）菌数汇报数（cfu/ml.g）原液1：10（-1）1：102（-2）1：103（-3）1—64826402—42064864003—不可计42064640004—00.50＜1005——00＜1006—000＜107000—＜1例：菌数汇报规则表1微生物检验技术基础知识第33页四、微生物程度检验法5.4.2薄膜过滤法滤膜孔径小于0.45μm，直径普通为50mm，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超出100ml，总冲洗量不得超出1000ml。贴膜

菌面朝上于对应琼脂培养基平板上培养，每种培养基最少制备一张滤膜。阴性对照试验（不得有菌生长）菌落汇报规则每张滤膜上菌落数应不超出100cfu，若滤膜上无菌生长，以＜1乘以稀释倍数值汇报菌数。微生物检验技术基础知识第34页四、微生物程度检验法5.5控制菌检验供试品控制菌检验应按已验证方法进行，增菌培养基实际用量同控制菌检验方法验证。阳性对照试验：加菌量为10～100cfu，阳性对照试验应检出对应控制菌。阴性对照试验：取稀释液10ml代替供试液，阴性对照应无菌生长。按照不一样给药路径，必检控制菌不一样。微生物检验技术基础知识第35页四、微生物程度检验法不一样给药路径制剂应检控制菌汇总药品给药路径应检控制菌说明局部给药制剂金黄色葡萄球菌全部制剂铜绿假单胞菌白色念珠菌阴道给药口服制剂大肠埃希菌全部品种大肠菌群含中药原药粉、沙门菌含动物组织（提取物）给药多路径给药制剂同时检验各给药路径应检控制菌微生物检验技术基础知识第36页四、微生物程度检验法5.6微生物程度检验法结果判断供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试；供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下要求，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果平均值汇报菌数；若供试品细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下要求，判供试品符合要求，反之判供试品不符合要求。微生物检验技术基础知识第37页