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杜长大断奶仔猪试验条件的选择

为了最大限度地提高经济效益，现代仔猪环境中的早期断奶技术通常被采用，但也带来了新的问题。“早期断奶仔猪风险综合征”就是其中之一。主要包括由营养、免疫、心理和环境刺激引起的仔猪食欲差、消化功能紊乱、生长缓慢、腹泻、饲料利用率低、竞争力低、死亡率高等问题。为此,在生产中普遍从营养方面入手,在饲料中添加利高霉素、杆菌肽锌、金霉素等抗生素作为饲料添加剂,对于控制疾病的发生、降低饲料增重比、促进动物生长、降低腹泻等方面具有良好的效果,但是长期利用抗生素容易造成药物残留、细菌产生耐药性、环境污染、畜产品质量和安全等问题。随着人们对畜产品质量和安全问题的日益关注,世界各国对抗生素使用的逐步全面禁止,人们寻找高效、安全抗生素替代品的愿望日益迫切,绿色饲料添加剂的研究也开始备受瞩目。其中,中草药因其具有来源天然、资源广泛、成本低廉、长期使用无残留、无毒副作用、药效不减、不易产生耐药性等特点而备受青睐。中草药作为新型安全的生物饲料添加剂,具有促进畜禽生长、抑制病原菌、增强免疫功能、提高抗病力等功效。结合本课题组前期的试验成果,本试验设计复方中草药的不同添加剂量,研究不同剂量的中草药添加剂对早期断奶仔猪生长性能、抗腹泻效果和肠道微生物的影响,筛选出中草药提取物的最优添加剂量,并为将其开发为一种环保、高效、安全的免疫促生长饲料添加剂提供理论依据。1材料和方法1.1复方中草药以干草粉或干草试验中草药复方组成为金银花、黄芪、茯苓、枸杞、马齿苋等。中草药复方分为提取(主要为黄芪、茯苓、马齿苋等)和不提取部分(主要为枸杞、金银花等),提取部分、不提取部分比例为3∶1。不提取部分复方中草药在65~70℃下烘干后,60目粉碎并于-20℃保存;提取部分采用醇-水提取法,首先复方中草药经65~70℃烘干后,40目粉碎过筛,并用50%的酒精浸泡36h以上,每一份药经冷凝回流3次,每次2h,药渣用200目的尼龙纱布过滤,并经人工挤压(尽量减少药渣内中药有效成分的残留),滤液用旋转蒸发仪回收其中的酒精并浓缩药液,提取物保存在4℃冰箱中。1.2中草药添加剂对断仔日粮蛋白质含量的影响选择优质玉米和豆粕,经65℃烘干,粉碎至40目,并按7∶4的比例混匀,作为中草药添加剂预混料的载体,其蛋白质的含量与断奶仔猪日粮相当。2个对照载体中分别加入中草药添加剂和抗生素(20mg/kg硫酸粘杆菌素+100mg/kg杆菌肽锌;硫酸粘杆菌素纯度10%,杆菌肽锌纯度15%)。中草药预混料再经65℃烘干,并粉碎至40目,按4∶2∶1分成3份,后2份按一定比例加入载体并混匀后备用,保存在干燥通风的地方。1.3饲养次数及培养条件本试验在浙江省农业科学院海宁试验基地完成。饲养管理按照养殖场的规定,每天饲喂3次(08:00、12:00、16:00),自由饮水,每次喂料要保证有一定量的剩余,并保证保育室中良好的卫生防疫条件。注意观察仔猪的采食、腹泻情况,试验期间腹泻仔猪不用药物治疗。1.4分组及日粮添加量选择健康无病的28日龄杜长大断奶仔猪135头,初始体重为(6.76±0.89)kg,并按体重、性别、窝别一致原则随机区组设计分成5组,每组分3栏,每栏9头。对照组饲喂基础日粮;试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在基础日粮中添加0.5%、1.0%、2.0%的中草药提取物;抗生素组在基础日粮中添加20mg/kg硫酸粘杆菌素和100mg/kg杆菌肽锌,各组基础日粮及营养成分相同(见表1)。试验从断奶开始,全期共35d,其中预试期7d,正试期28d。1.5空腹称重及一般日食量在正试期第1、14天和28天08:00空腹称重,并计算采食量;分别计算各阶段各处理日平均采食量(ADFI)、日增重(ADG)和饲料增重比(F/G)。1.6粪样的品种每日观察3次(早、中、晚各1次)仔猪腹泻情况,其粪便情况大致分为4种,分别是正常粪便、不成形粪便、稠状液体粪便、稀的液体状粪便。出现后2种情况粪便的仔猪视作腹泻。正试期开始每日记录每组腹泻仔猪头数,计算腹泻率:腹泻率=腹泻仔猪总头日数/(试验总仔猪头数×试验总天数)×100%。1.7肠微生物范围1.7.1粪样的采集和保存正试期第28天晨饲前,各组随机选取5头仔猪,从肛门处无菌采集粪样。样品中添加15%的甘油于-20℃下保存。在DNA提取前,解冻样品,移去液相称取200mg湿重的粪样,用于DNA的提取。1.7.2pcr引物采用粪便DNA纯化试剂盒(Simgen,杭州),提取粪便总DNA。随后对细菌的16SrDNA的V6-V8区片段进行PCR反应,PCR引物为带有GC夹子的U968-GC(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′)和L1401(5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′)。吸取5μL产物,进行1.2%琼脂糖电泳,电泳结果与标准DNAMarker进行比对,片段长度为470bp左右。1.7.3凝胶电泳检测dage分析参照文献,对细菌16SrDNA的V6-V8可变区的扩增产物进行DGGE分析。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝胶(含丙烯酰胺、双丙烯酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),其中尿素浓度梯度为35%~55%。电泳采用美国CBS2401变形梯度凝胶电泳仪,使用0.5×TAE缓冲溶液,先在200V电压下预电泳10min,随后在120V的固定电压下电泳16h。电泳结束后,立即进行硝酸银染色,凝胶经密度校正仪(Bio-Rad,Gs-800)扫描。DGGE凝胶用QuantityOne4.6.3软件(Bio-Rad,美国)进行菌群相似性和多样性分析。包括丰富度(S),即DGGE图谱每条泳道的条带数;微生物区系多样性指数,Shannon-Wiener指数(H′),采用UP-GMA相似性聚类分析。按照如下公式进行计算其中,Pi为泳道中i条带出现的可能性;Pi=ni/H,ni为某1条带的峰高,H为泳道密度曲线所有峰高的总和。1.7.4在dgge手册中，对一些优势条带的研究顺序进行分析1.8统计分析采用SAS软件的GLM程序对数据进行统计分析,各试验组之间参数采用Duncan′s新复极差法进行差异显著性检验。2结果与分析2.1生长性能2.2各组大鼠血清第1、4周、第3周的试验结果由表3可见,正试期第1、3、4周,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组仔猪的腹泻率较对照组均有显著下降(P<0.05),且第1、4周与抗生素组差异不显著(P>0.05),第3周试验Ⅱ组与抗生素组无显著差异(P>0.05);第2周及试验全期,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组仔猪的腹泻率极显著低于对照组(P<0.01),且均与抗生素组无显著差异(P>0.05)。2.3srrna序列及聚类分析如图1所示,为仔猪直肠粪样DGGE图谱,图谱上的泳带反映了粪样中的优势菌群,泳带数量和位置的复杂性说明了菌群的多样性。处理组内和组间仔猪的直肠微生物DGGE图谱具有很多相同泳带。经过DGGE图谱各条泳带之间的比较,可以发现3个特异性条带(a、b、c),其中,a条带为所有中草药组共有,b、c条带为0.5%和1.0%中草药组特有。基因序列分析表明,a、b、c条带的16SrDNA片段序列长度分别为395、393、579bp,与基因数据库登录的相关序列的相似性分别为96%、90%、93%,这3个特异条带所对应的细菌分别为1.0%组的非培养真杆菌和1.0%组的HS-136枯草芽孢杆菌(Bacillussp.HS-136partial16SrRNAgene,strainHS-136)、0.5%组的非培养真杆菌。从DGGE图谱的条带数来看(图2),对照组、0.5%和1.0%中草药组都显著多于抗生素组(P<0.05);其中,0.5%组显著多于对照组、1.0%和2.0%组(P<0.05),且显著多于抗生素组(P<0.01)。通过计算各试验组DGGE图谱中泳道中条带的H′指数(图3),可以发现对照组和中草药各组都显著高于抗生素组(P<0.05);其中以0.5%组多样性指数最高。由图4可见,通过UPGMA相似性聚类分析,所有的条带数分为2类,其中Ⅰ类(除了20号)为空白组和抗生素组的DGGE图谱,相似性指数大都低于60%,甚至更低;所有中草药组的DGGE图谱大都归为第Ⅱ类(除5号和23号),并且相似性都大于60%。3讨论3.1复方中草药提取物对断裂强度的影响中草药提取物中含有多种生物活性成分,按一定比例添加于基础日粮中,可以增加动物的营养,增强机体的新陈代谢,提高机体免疫力,从而使得动物健康快速的生长。本试验采用金银花、黄芪、茯苓、枸杞等多味中药配伍,其主要有效成分为多糖、黄酮类、有机酸、生物碱和挥发类物质等。复方中草药提取物能够有效地提高断奶仔猪日增重和饲料转化率。有研究在玉米-豆粕型基础日粮中添加2g/kg中草药超微粉末,结果表明,21日龄断奶仔猪日增重、采食量较空白组分别显著提高19%、20%,第3周饲料增重比显著降低11.00%。本研究的结果同前几位研究者的结果相似,中草药组与对照组相比,ADFI和ADG都有增加,并且ADFI、ADG和F/G与抗生素组均无显著差异,其中0.5%中草药的作用效果与抗生素组较为接近,这可能是由于高剂量的中草药会影响饲料的气味,从而减少了仔猪的采食量,一定程度上抑制了仔猪的生长。3.2中草药添加剂对东南角腹泻的影响本试验的复方中草药由理气健脾的枸杞和茯苓、清热抗菌的金银花、补气杀虫的黄芪和马齿苋配伍而成,能够改善动物消化系统,降低断奶仔猪的腹泻,从而提高饲料的消化吸收,最终促进动物的生长发育。饶骏等研究了中草药添加剂与土霉素对荣昌仔猪腹泻的影响,结果发现中草药配方2(黄芪∶制首乌∶神曲∶淫羊藿=3∶2∶3∶3)的效果最好,腹泻率比对照组降低了11.03%,略优于抗生素组。日粮中添加超微粉碎中草药,腹泻率在试验期的第2周和第3周显著下降,特别是在第3周,2.0g/kg超微粉碎中草药的抗腹泻效果显著优于抗生素。从本试验的结果来看,复方中草药可以有效地降低断奶仔猪腹泻率,低剂量的中草药添加剂效果接近于抗生素。这可能是由于中草药提取物能够有效调理肠胃,改善肠道微生物菌落,进而提高机体的免疫功能,减少应激反应,最终降低仔猪腹泻的发生。3.3药组大鼠dage图谱从生长性能来看,0.5%中草药组仔猪的生长性能与抗生素作用效果相当;复方中草药对断奶仔猪腹泻的治疗效果接近于抗生素;饲喂复方中草药对仔猪直肠微生物区系产生了一定的影响,提高了直肠菌群数量,促进了有益菌的生长。这可能与复方中草药具有调理肠胃、杀菌抑菌、提高机体免疫力有关,然而抗生素在杀灭有害菌的同时,也可能会抑制有益菌的生长。本研究发现,抗生素可以减少仔猪直肠细菌数量,且组内动物之间肠道细菌相似性下降。而在中草药组仔猪的DGGE图谱上发现了3个特异性条带,为2种细菌,分别为枯草芽孢杆菌和非培养真杆菌。枯草芽孢杆菌作为有益菌,是由一类在逆境下可以形成休眠体芽孢以抵抗不良环境的好氧革兰氏阳性菌,特点是耐酸、耐盐、耐高温和耐挤压,并可以产生多种酶类,如蛋白酶、淀粉酶、脂酶等。它的生物作用包括生物夺氧,抑制有害菌;拮抗病原微生物,维持和调整肠道微生态平衡;产生有益代谢产物;增强免疫机能,提高抗病能力。芽孢杆菌可竞争性抑制病原微生物黏附到肠黏膜上皮细胞上,同病原微生物争夺有限的营养物质和生态位点。并且芽孢杆菌在胃肠道上部可产生乳酸、丙酸、乙酸等物质使得肠道内的pH降低,在肠道下部产生挥发性脂肪酸,抑制有害微生物的生长,并有助于动物特别是幼小动物营养物质的消化,尤其是蛋白质的消化吸收。真杆菌也是一种有益菌,具有抑制外来菌的作用,具备完全的有益作用,在胃肠道合成维生素和蛋白质,辅助消化吸收,抑制病原微生物生长,刺激和兴奋免疫系统。目前国内外对于真杆菌的作用机理报道较少。本试验中,枯草芽孢杆菌HS-136仅存在于0.5%和1.0%复方中草药组中,真杆菌则来自中草药各个添加剂量组,这可能与复方中草药兼具药用和营养的双重功效有关,并且复方中草药的许多有效成分能够促进有益菌的定植,同时抑制有害菌的生长,使得肠道菌群更加稳定,消化功能更加完善,最终降低了仔猪的腹泻,提高其生长性能。复方中草药促进有益菌生长确切的作用机理,还需要进一步试验的探明。4中草药提取物的用量本试验发现,复方中草药可以有效地改善断奶仔猪肠道微生物区系,促进有益菌的生长,进而有效降低腹泻率,减少应激反应,使得仔猪能够健康快速成长;不同添加剂量在一定程度上可以影响复方中草药的作用效果,其中以添加0.5%中草药提取物效果较好。由表2可见,各组采食量、日增重和饲料增重比之间没有显著差异(P<0.05)。