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基于响应面法优化鸡花青素提取工艺

1材料和方法1.1仪器和设备广州玉立宝科技有限公司；盐酸、石油醚和丙酮的市场价格分析：。JB200-D型强力电动搅拌器、DS-1型高速组织捣碎机上海标本模型厂;HH-S型恒温油浴锅金坛市富华仪器有限公司;himacCR22G型高速冷冻离心机日本日立公司;HHS型电热恒温水浴锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂;ALPHA1-4型冷冻干燥机德国CHRIST公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂;MM12型绞肉机广东省韶关市食品机械厂。1.2实验方法1.2.1关于乌江的酶分解方法，参考文献1.2.4不同处理法破碎油脂将抽滤分离出的黑色素分别用蒸馏水洗涤3次、石油醚洗2次、丙酮洗涤2次、蒸馏水洗涤2次,去除残余油脂,每两次之间洗涤液浸泡黑色素的时间为20min。1.2.7影响激素提取率的因素考察盐酸浓度、盐酸体积与黑色素渣体积比、油浴温度、油浴时间4因素对黑色素的提取率的影响。选取影响较显著的3个因素采用DX软件进行响应面实验设计并进行分析,确定出最佳工艺。2盐酸浓度对提取率的影响由图1可知,盐酸浓度由4mol/L增加至6mol/L时,黑色素提取得率逐渐上升,并在6mol/L时提取得率达到峰值。当盐酸浓度高于6mol/L后,黑色素的提取得率反而下降。可能原因是盐酸浓度太高时导致了部分乌鸡黑色素被破坏,从而使得黑色素的得率降低因此提取黑色素时应选取的盐酸进行油浴,以获得较高的得率。2.2不同激素渣体积对乌苏叶案得率的影响由图2可知,随着盐酸体积与黑色素渣体积比的增大,黑色素的得率先升高后降低,在盐酸体积∶黑色素渣体积为2∶1时,乌鸡黑色素的得率最大。可能原因是当盐酸体积与黑色素渣体积比过大时,提取所用盐酸的量过大,导致反应物浓度过稀,反而不利于反应的进行,进而导致提取得率降低。因此,为了得到较高的黑色素得率,应该选用盐酸体积∶黑色素渣体积为2∶1进行提取。2.3不同温度对乌苏叶色滤料提取率的影响由图3可知,油浴温度对乌鸡黑色素的提取得率有较大影响。乌鸡黑色素的提取得率随着提取温度的升高(100～105℃)有所上升,可能原因是由于乌鸡黑色素与蛋白质紧密结合在一起,在100℃时,温度还不足以完全破坏黑色素与蛋白的缔合键,所以得率较低。提取温度为105℃时,乌鸡黑色素与蛋白质的结合键被完全破坏,黑色素才游离出来,使得提取得率最大。当温度超过105℃后,乌鸡黑色素的提取得率反而下降,可能原因是温度过高,破坏了游离出来的部分乌鸡黑色素,导致得率有所下降。所以,出于最高提取得率考虑,应该首选105℃作为油浴温度。2.4油浴时间长由图4可知,随着油浴时间的变化,乌鸡黑色素的得率先升高后降低。在提取时间为14h时,提取得率最大。在13h时提取得率较低,可能是由于油浴时间不够长,导致黑色素与蛋白结合的键还没有完全被破坏,黑色素没能彻底游离出来;在14h时,由于黑色素与蛋白结合的键完全被破坏,黑色素完全游离出来,所以得率最大。当油浴时间过长,黑色素的提取得率反而降低,可能是由于油浴时间过长,导致部分黑色素被破坏,提取得率降低。在18h时黑色素的提取得率反而升高,可能是由于实验误差导致。因此,综合考虑,油浴时间应该选择14h。2.5反应分析对黑色素提取的优化2.5.1油浴温度和盐酸与渣体积比对激素得率的影响根据单因素实验,选择油浴温度、盐酸浓度和盐酸与渣体积比3个因素,以黑色素得率为响应值,采用响应面分析法在3因素3水平上对乌鸡黑色素的提取条件进行优化,实验设计见表1,实验结果表略。由响应面软件Design-Expert7.0得到的分析结果可知;R2=0.9774、失拟项不显著(0.0761>0.05),说明回归方程的拟合程度较好,模型是显著的。回归模型的F-检验显著,说明所拟合的二次回归方程合适,该模型的预测值和实际值比较接近(如图5)。以黑色素得率为响应值,经回归拟合后,各因子对响应值的影响可用下面回归方程表示:由实验结果可知X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X12对黑色素的得率有比较显著的影响,而其他因素的影响相对较小。油浴温度和盐酸与渣体积比之间的交互作用如图7所示,比较在相同盐酸与渣体积比条件下油浴温度对黑色素得率的影响可以发现,当盐酸与渣体积比较小时,黑色素的得率随着油浴温度的增加呈现先增加后减小的趋势;而当盐酸与渣体积比较大时,黑色素的得率随着油浴温度的增加也是呈先增加后减小的趋势,但变化并无盐酸与渣体积比较低时剧烈。可能由于油浴温度低于最适酸解温度时,随温度的增加,酸解反应更加充分,黑色素的得率逐渐升高。当油浴温度超过最适酸解温度时,高温对黑色素的破坏导致其得率反而降低。在相同的油浴温度下,黑色素的得率随着盐酸与渣体积比的增大而逐渐增大。但在盐酸与渣体积比较小时,黑色素的得率变化较为显著,而在盐酸与渣体积比较大时黑色素得率的增加趋于平缓,其原因可能是盐酸与渣体积比较大时,盐酸的量已经超过最佳值,因而致使变化并不如盐酸与渣体积比较小时显著。盐酸与渣体积比与油浴温度之间存在协同关系,在油浴温度105℃左右,稍微升高油浴温度的同时适当增加盐酸与渣体积比就能进一步提高黑色素的得率。盐酸浓度和盐酸与渣体积比之间的交互作用如图8所示,在不同的盐酸浓度下,盐酸与渣体积比对黑色素的得率影响趋势基本相同。随着盐酸与渣体积比的增大,黑色素的得率呈现上升趋势。在盐酸浓度较低时,黑色素的得率随着盐酸与渣体积比的增大增加较为平缓;在盐酸浓度较高时,黑色素的得率随盐酸与渣体积比的增大增加得更为显著。当盐酸与渣体积比较小时,黑色素的得率随着盐酸浓度的增大变化较为平缓,呈先减小后增大的趋势;当盐酸与渣体积较大时,黑色素的得率随着盐酸浓度的增大变化较为显著,呈逐步增大的趋势。盐酸浓度与盐酸与渣体积比之间存在协同作用,在增大盐酸浓度的同时,于最佳盐酸与渣体积比范围内稍微增大体积比就能较显著地提高黑色素的得率。2.5.3油浴提取乌苏烷的最佳条件为了进一步确定最佳点的值,对回归方程取一阶偏导等于零,得X1=1.0281,X2=-0.5374,X3=-0.3270,即油浴提取乌鸡黑色素的最佳条件为:油浴温度103.3650℃、盐酸浓度5.7313mol/L、盐酸与渣体积比1.8365,在此条件下,乌鸡黑色素的得率理论值可达6.56‰。2.5.4油浴最佳条件的确定为了检验RSM分析的可靠性,采用上述最优工艺条件进行接枝实验,同时考虑实际操作的便利,将油浴提取乌鸡黑色素的最佳条件修正为:油浴温度103℃、盐酸浓度5.7mol/L、盐酸与渣体积比1.8,重复实验三次,得测定值为6.32‰,预测值为6.38‰。验证实验结果与理论预测值误差在1%以内,证明优化结果可信,具有实用价值。3乌苏氏酶解法提取思想本文在研究乌鸡黑色素提取时各因素对提取得率的影响的基础上,采用响应面分析法对乌鸡黑色素的提取工艺进行优化最优工艺条件为油浴温度103℃、盐酸浓度5.7mol/L、盐酸与渣体积比1.8,利用最优条件提取乌鸡黑色素,提取得率为6.32‰,与响应面模型所预测的提取得率6.38‰十分接近,验证了响应面模型的强大分析功能,并为乌鸡黑色素的提取提供了理论依据。乌鸡(WhiteSilkieBantams)是闻名中外的药用家禽,具有特殊的药用、营养及观赏价值。乌鸡在表型性状上与普通鸡最明显的差异是体内含有大量黑色素。现代医学研究表明,乌鸡黑色素有清除自由基和抗氧化作用,可以抗衰老,提高免疫力。因此,如何有效地提取乌鸡黑色素便成为当前研究的热点。袁缨曾经对乌鸡黑色素的提取进行过研究,但是该法需回流长达50h,耗能太大。蔡华珍曾用酸性蛋白酶于低酸环境下酶解20h后,直接用石油醚、水洗涤后冻干为成品,但是该法只用酶解,而且酶解时间太长,后期的酶活已经下降,很难确保蛋白被酶解完全,黑色素的纯度亦很难保证。鉴于这些不足,本文首创利用改进的酶解与盐酸回流相结合的方法,对乌鸡黑色素进行了提取,并研究了盐酸浓度、盐酸体积与黑色素渣体积比、油浴温度、油浴时间对黑色素得率的影响,进而采用响应面分析法优化提取工艺。1.2.2黑色素的初步分离将酶解液离心后可得上中下三层,把上层和下层收集备用。1.2.3油浴将粗分离含黑色素渣加入一定浓度的盐酸后,于恒温油浴锅内油浴一定时间之后,抽滤分离出黑色素。1.2.5冷冻干燥将已经洗涤干净的样品置于冷冻干燥机内干燥40h后,取出称重,计算得率。1.2.6提取得率的计算2.1盐酸浓度对黑色素得率的影响2.5.2油浴温度对血药浓度的影响油浴温度和盐酸浓度之间的交互作用如图6所示,油浴温度较低时,乌鸡黑色素的得率随着盐酸浓度的变化不明显,这可能是由于油浴温度低于蛋白酸解的最佳作用温度时,盐酸未能将乌鸡蛋白充分酸解;当油浴温度升高到酸解最佳温度范围时,黑色素的得率随着盐酸浓度的增加而显著增加;当油浴温度高于蛋白酸解的最佳温度范围时,黑色素的得率随着盐酸浓度的增加亦有缓慢增长,但并不显著。在相同的盐酸浓度下,黑色素的得率随着油浴温度的变化而显著变化;当油浴温度低于最适酸解温度时,黑色素得率随着油浴温度的升高而显著增加;当油浴温度高于最适酸解温度时,黑色素的得率随着油浴温度的升高反而显著减小。这可能是由于酸解温度高于最适温度时,乌鸡黑色素结构被破坏,导致黑色素的得率显著减小。由此可见,油浴温度和盐酸浓度之间的交互作用显著。