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锁阳药材hplc指纹图谱和有效成分含量测定

cykorrizan是cykorrizan科的一种寄生植物。它通常生长在位于栽培植物白刺（nidaribircam）的干燥部位。主要生长于干燥和碱性沙地。主要产于内蒙古、新疆、甘肃、青海等西北地区。锁阳味甘、性温,具有补肾、助阳、益精、润肠养筋之效用,中医用于治疗阳痿、遗精、不孕、腰膝酸软、肠燥便秘等。现代药理学研究表明:锁阳具有提高机体免疫力、清除自由基、抑制人体免疫缺陷病毒(HIV)、抑制血小板聚集和雌激素样等多种药理活性。锁阳中的化学成分主要有有机酸、黄酮类、酚类、甾体类、三萜类、鞣质、糖苷等多种成分,其中黄酮类成分具有提高机体免疫力、清除自由基的活性。近年来,指纹图谱技术已被许多国家和国际组织用于天然产物的质量控制,尤其是HPLC指纹图谱,已广泛用于中药的鉴别和质量控制,并取得重要的进展。本文利用HPLC建立锁阳指纹图谱,并建立同时测定锁阳中有效成分儿茶素、根皮苷的方法,为锁阳质量控制和有效利用提供参考。1仪器、试剂和材料1.1高效液相色谱仪仪:dz体调温热电套,as-ap18-一种RE-52C型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂);SHZ-DⅢ型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DZTW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);Agilent1200高效液相色谱仪(AgilentTechnologies,USA),包括G1312ABinarypump,aG1315BDAD,G1328BManualinjector,Autosampler,AgilentChemstationsoftware;ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大连依利特分析仪器有限公司)。1.2标准试验剂:siga儿茶素对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号:877-200001),根皮苷对照品(美国Sigma公司,批号:083K7072);乙腈为色谱纯(山东禹王实业集团禹城化工厂),其它试剂均为分析纯,纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。锁阳样品由中科院兰州化物所戚欢阳副研究员鉴定为锁阳科植物锁阳CynomoriumsongaricumRupr.的肉质茎(样品信息见表1)。2方法和结果2.1样品溶液和对照溶液的制备2.1.1超声-滤渣法将锁阳样品粉碎,过40目筛,准确称取2g,置于具塞三角瓶中,加入15ml甲醇,在温度为40℃,频率为50kHz条件下超声30min后,抽滤。滤渣再同法提取2次,合并3次滤液,浓缩至近干,加入甲醇溶解转移定容至5ml容量瓶中,备用。临用前取上清液,经0.45μm滤膜过滤后进样分析。2.1.2%/ml和0.“ml”溶液精密称取儿茶素和根皮苷对照品适量,分别用甲醇溶解定容到容量瓶中,配成浓度分别为0.6020mg/ml和0.1936mg/ml溶液。分别精密量取上述溶液各1ml,置5ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到浓度分别为0.1204mg/ml(儿茶素)和0.0387mg/ml(根皮苷)的混合对照品储备液,备用。2.2流动相-乙腈相法色谱柱为ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大连依利特分析仪器有限公司);流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱:0～20min,10%～40%(A),20～60min,40%(A);流速1.0ml/min,检测波长280nm,柱温为室温,进样体积20μl,自动进样器进样。2.3锁阳指纹图谱的建立对上述条件下的液相色谱指纹图谱分析比较和对已知化合物的确认,并将色谱信息通过相似度软件计算,从10个样品的色谱信息中获取共有峰,建立锁阳指纹图谱,见图1。共有峰的相对保留时间、相对峰面积见表2～3。2.4重复性和线性范围取1#样品溶液,连续进样5次,测得各共有峰相对保留时间和峰面积的RSD值均小于5%。其中:儿茶素和根皮苷的相对保留时间的RSD值分别为0.18%和0.32%(n=5),相对峰面积的RSD值分别为0.97%和2.18%,表明精密度良好。取1号样品6份,分别精密称定,按照“2.1”项方法制备样品溶液,利用“2.3”项建立的色谱条件进样分析,测得每份样品中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5%。其中:儿茶素和根皮苷的相对保留时间的RSD值分别为1.42%和2.16%(n=5),相对峰面积的RSD值分别为1.94%和2.95%,表明其重复性较好。2.4.4线性关系、相关系数和线性范围分别精密量取等量的儿茶素、根皮苷对照品溶液,均匀混合后,用自动进样器分别吸取对照品溶液1,2,5,10,15,20μl,利用“2.3”项建立的色谱条件进样分析。以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,分别得到儿茶素和根皮苷的线性关系、相关系数和线性范围:Y=70.992X-31.927,r=0.9996,0.1024～3.612μg(n=3);Y=91.91X-8.7264,r=0.9998,0.0387～1.1616μg(n=3)。2.5加样回收率测定总成分配比的确定精密称取适量已知含量的锁阳样品6份,分别加入适量儿茶素和根皮苷的对照品,按照“2.1”项方法制备样品溶液,利用“2.3”项建立的色谱条件进样分析,测定儿茶素和根皮苷的平均回收率分别为100.5%(RSD=1.87%),99.3%(RSD=2.54%)。结果见表4。3讨论3.1样品预处理和色度条件的优化3.1.1提取条件的筛选分别考察了50%甲醇、甲醇和乙醇3种提取溶剂。经考察发现50%甲醇、乙醇作为提取溶剂时,提取物中成分复杂,干扰儿茶素与根皮苷的分离。甲醇作为提取溶剂既能提取所需要的成分,又能减少大量其它物质的干扰,所以选择甲醇作为提取溶液。以甲醇为提取溶剂,分别考察了回流提取法、超声提取法、索氏提取法对提取的影响。研究表明:在温度为40℃,功率为50kHz的超声提取条件下含量最高,并且操作简单方便。在此基础上利用正交实验优选了最佳提取条件,正交实验结果见表5。由表5可知:所得最佳提取条件为2g药材超声提取3次,每次加入15ml甲醇,每次提取30min。3.1.2流动相及色谱波长的选择为了选择适宜的检测波长,以便最大限度获取色谱信息满足建立指纹图谱的需要,同时,还要兼顾两个主要成分的测定,分别在230,254,280,360nm波长处考察色谱信息,最终选择280nm为检测波长。在选择流动相时,发现儿茶素只有在流动相极性很大的条件下才能完全分离,根皮苷却要在有机相比例较大的条件才能有效分离,所以采用梯度洗脱。再比较甲醇水体系和乙腈水系统,发现乙腈水体系分离效果好于甲醇水体系。3.2地域间不同地域间药材互作中儿茶素和根皮苷含量差异大,当地供热体中儿茶素的含量大,当地分布差不同产地锁阳中儿茶素与根皮苷的含量测定结果见表6。结果发现青：Ｎ髦莸暮孔罡,内蒙古巴盟的含量最低,各产地药材中儿茶素与根皮苷的含量差异大,这可能是不同地域生态环境的差异导致其中次生代谢产物有较大差别。2.4.1稳定性试验结果取1号样品溶液,分别在1,2,4,6,8,12,48h进样,测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于5%。其中:儿茶素和根皮苷的相对保留时间的RSD值分别为0.26%和0.43%(n=5),相对峰面积的RSD值分别为1.42%和3.08%,表明稳定性良好。表明样品溶液在48h内稳定。2.4.2稳定性2.4.3重复