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电针刺激足三里穴位对神经病理性疼痛大鼠痛响应磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径的影响

电针(ea)可以降低或治疗神经退行性疼痛(pd)。电针镇痛机制主要分为阿片机制和非阿片机制,非阿片机制主要包括:激活大脑中的血清素能或去甲肾上腺素能下行抑制系统、增加生长抑素(somatostatin,SOM)表达和激活胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)与生长因子α-1(GFRα-1)等。脊髓及背根神经节中丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)家族在NP的发生和发展过程中起重要作用。本研究拟观察EA对坐骨神经结扎损伤(chronicconstrictioninjury,CCI)大鼠脊髓背根神经节p38MAPK表达的变化,以探讨EA的镇痛机制。方法1.cci大鼠模型建立及分组40只健康雄性Wistar大鼠(200~230g)被随机均分为4组(n=10):对照组(Con组),不给予大鼠行任何处理。其余30只大鼠,参照BennettandXie的方法建立CCI模型:将大鼠用2%~3%的七氟烷进行吸入麻醉,充分暴露右侧坐骨神经主干长约7mm,用4-0的羊肠线以宽度约2mm的间隔打4个松紧合适的结。操作结束后逐层缝合肌肉及皮肤;然后将CCI模型成功大鼠30只随机分为3组(n=10):CCI组,模型成功后不予处置;假电针组(CCI+A组),对CCI大鼠进行假电针治疗,即只将针灸针插入双侧足三里穴位,但不给予电刺激;电针治疗组(CCI+EA组),CCI大鼠,在造模成功后第15d开始给予电针刺激治疗。2.“足三里”穴位的选取在安静舒适的环境中,每天上午9:00~10:00将模型成功大鼠放置于自制固定装置,能够暴露四肢及尾部,但不能自由活动。待大鼠安静后,根据先前的文献描述选取“足三里”穴位,将华佗牌针灸针(直径:0.25mm;长度:30mm;苏州医疗用品厂有限公司,苏州)插入双侧“足三里”穴位,深度约为5mm。然后将电刺激仪(长城牌KWD-808,杭州丹顿医疗器械有限公司,杭州)连接在两只针灸针上,给予连续波(频率:2HZ,强度:3mA)进行电刺激治疗。从模型成功后第15天开始,每天1次,每次20min,连续治疗7次。3.环境适应测定观察各组大鼠的一般生长情况,并记录大鼠体重、饮食等情况。分别在实验前及实验的第7、14、21d,测定大鼠的热缩足反射潜伏期(pawwithdrawalthermallatency,PWL)和机械缩足反应阈值(pawwithdrawalmechanicalthreshold,PWT)。测定前所有大鼠都在被测装置中进行每天15min的环境适应,共两天。(1)PWL的测定:设定热板仪(modelYLS-6B,益延科技发展有限公司,山东)的温度为52℃,使大鼠的基础PWL为15s左右,并在实验过程中保持一致。将大鼠置于安静舒适的环境中,等待大鼠的梳理和探究活动基本消失;然后将大鼠放到热板仪上,当大鼠迅速抬足、舔足时,记录此刻的时间,即为PWL。每只鼠测3次,每次间隔10min,取3次的平均值作为PWL值。(2)PWT的测定:将大鼠置于金属网格笼子(18cmx8cmx8cm)中,先让大鼠适应环境;待大鼠的梳理和探究活动基本消失,足底伸展适中后,用范围是0.6~15.0g的vonFrey纤维丝(Stoelting公司,美国)刺激大鼠右足底测定PWT。测量时将vonFrey纤维丝从铁丝网格笼子下方竖直向上抵住大鼠右后肢足底中心部,使之弯成S形,持续5~6s;在刺激时间内或在移开vonFrey纤维丝时大鼠有抬足、躲避、舔足等动作则视为阳性反应,而身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应。按Chaplan等报道的“upanddown”的方法,计算大鼠50%机械缩足反射阈值。每只鼠测3次,每次间隔10min。4.术后运动情况参照Hwang所描述的方法,分别观察实验前及实验后第7、14、21d,电针治疗后大鼠受累后肢的运动情况。将运动功能共分为4级:0分没有运动改变,正常行走;1分轻度运动功能减弱,对足底的刺激缩爪反应正常;2分自主活动减弱,中度运动功能减弱,正常行走,对足底的刺激有缩爪反应,但减弱;3分不能自主活动,不能行走。有拖爪现象,对足底的刺激没反应。5.免疫阳性细胞的表达在实验结束后将大鼠全部在深麻醉下进行灌注、取材、固定。首先经鼠尾静脉行全身肝素化,然后左心室插管灌注250ml的4℃盐水,继之灌注4%多聚甲醛250ml。灌注完毕后固定2h,在冰板上将大鼠右侧的L4~6背根神经节取下,置于多聚甲醛中4℃固定备用。按照试剂的说明及免疫组化的步骤将磷酸化p38(p-p38MAPK)的一抗(CellSignaling公司,美国)按1:200的浓度滴加在组织切片上,经过二抗孵化、DAB复染等步骤,最后在显微镜下观察p-p38MAPK免疫阳性细胞的表达。阳性细胞参照文献进行计数:随机选取每组大鼠的背根神经节切片,在400倍的视野下,每张切片上随机选取6个视野进行观察,以细胞内出现棕黄色颗粒计为阳性细胞。采用双盲法在具有网格测微尺的目镜下观察并计数细胞总数及阳性细胞个数,计算阳性细胞的平均百分率。6.资料处理及测量方差分析数据采用SPSS16.0软件处理,正态计量资料以“均数±标准差”表示,组间比较采用单因素方差分析,连续性资料采用重复测量方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.cci+ea对大鼠坐骨神经粘结模型的影响Con组大鼠生长状况良好,体重均衡提高,饮食状况良好。其余3组CCI大鼠生长状况良好,饮食良好,体重提高较慢,但与Con组比较无显著性差异。CCI模型成功大鼠均出现了典型的坐骨神经结扎模型的姿势:跛行、受累后肢外翻及受累后肢肌肉萎缩等症状。但在CCI+EA组,大鼠跛行、后肢外翻等症状都得到了一定的改善。实验过程中CCI组和EA组中各死亡大鼠1只、CCI组大鼠出现自噬1只、CCI+A组大鼠中有1只未出现痛觉过敏,均被筛选出去,在实验过程中对应补齐数据。2.4骨神经结构特征4组大鼠的PWL基础值相近,相互之间无显著性差异。CCI大鼠从坐骨神经结扎后第3d开始PWL即开始降低,并于第14d降到最低。第21dCCI+EA组PWL显著高于CCI、CCI+A组(P<0.05,见表1)。PWT变化趋势同PWL(见表2)。3.运动障碍dCon组大鼠未出现运动功能改变,运动功能评分为0。其余3组大鼠受累后肢于实验开始第3d出现明显的运动功能障碍。CCI组和CCI+A组大鼠运动功能评分持续升高,而CCI+EA组大鼠受累后肢的运动功能从第2次电针治疗后(即第16d)就开始逐渐改善,CCI+EA组和CCI组、CCI+A组比较,运动功能评分显著地降低(P<0.05,见表3)。4.cci和cci+a对大鼠免疫阳性细胞的影响免疫组化结果显示:p-p38MAPK阳性细胞为棕黄色的胞浆或胞核着色,多数呈圆形或椭圆形。在Con组大鼠背根神经节中p-p38MAPK免疫阳性细胞的表达较少(7.37%±0.64%),而在CCI组(61.57%±2.22%)及CCI+A组(63.20%±1.44%)大鼠中的表达则显著升高。经过电针治疗后,CCI+EA组(15.38%±1.77%)大鼠背根神经节中p-p38MAPK阳性细胞数显著低于CCI组及CCI+A组(见图1,2,P<0.05)。背根神经节中p-3gpbk表达的变化本实验成功复制了CCI模型,PWL、PWT和运动功能评分显著下降,免疫组化结果显示CCI模型大鼠背根神经节中活化的p-p38MAPK表达有显著升高。电针刺激“足三里”穴位改善了CCI大鼠痛觉过敏症状和受累后肢运动功能,同时抑制背根神经节中p-p38MAPK的表达。研究发现:MAPK是信号从细胞表面传导至细胞核内部的重要传递者,通过对转录因子的磷酸化来调节参与细胞反应基因的转录表达,包括p38MAPK、细胞外信号调节激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)和c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)。p38MAPK通过对细胞转录、蛋白合成和受体表达等的调节,在神经元的可塑性变化及痛觉信息转导中起重要作用。Katsura等发现:在脊神经结扎模型(SNL)中,脊神经损伤的同侧脊髓背角小胶质细胞p-p38MAPK免疫荧光水平和蛋白水平均明显增加,而神经元和星形胶质细胞中则无表达,这表明小胶质细胞内p38MAPK的活化在NP中起重要作用。而CHU等发现:在坐骨神经结扎后的大鼠的同侧背根神经节中p-p38MAPK表达是增强的;本实验结果也显示CCI大鼠背根神经节中p-p38MAPK随着机械痛觉过敏及热痛觉过敏的形成而表达增强,与CHU的研究结果一致。再次证明了磷酸化的p38MAPK在神经病理性疼痛的形成及发展过程中的重要作用。中右下角有,但是显示不清楚,排kok电子竞技时请加粗)但是遗憾的是我们并未对背根神经节中的神经细胞使用特异性标记物进行标记,因此不能够明确的表明p-p38MAPK是在何种细胞中表达的,我们将在以后的实验中进行深入的研究。38MAPK38MAPK阳性细胞率的比较nthefourgroupsatthe;*P<0.05,ComparedLao等研究发现:EA可减轻弗氏完全佐剂诱导的痛觉过敏模型中大鼠的疼痛,EA的抗痛觉过敏呈参数依赖和穴位特异性。3mA电针在痛觉过敏的治疗上比低强度(1~2mA)有效,作用20min效果最佳;2Hz电流对减轻冷痛觉异常比100Hz的电针效果更好;尽管EA对NP有较好的镇痛效果,但具体机制尚不清楚,目前认为可能有阿片机制和非阿片机制。非阿片机制主要包括:抑制脊髓中COX-2的表达;激活胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)与生长因子α-1(GFRα-1);增加生长抑素(SOM)表达;抑制神经元活化,调节脊髓神经元可塑性;抑制孤啡肽及抑制下丘脑蛋白表达等。本实验显示EA刺激“足三里”穴位能够有效的降低CCI模型背根神经节中p-p38MAPK蛋白的表达,同时随着p-p38MAPK表达的降低,痛觉过敏及大鼠受累后肢的运动功能也得到了良好的改善。Chang等在完全弗氏佐剂诱导炎性痛模型中证明,EA刺激“足三里”和“昆仑”两个穴位,能够有效抑制脊髓中p-p38MAPK的表达,此结果与本实验一致。因此,我们推论抑制背根神经节中p-p38MAPK的表达可能是EA治疗NP的机制之一。本实验采用的CCI模型制备简单,对大鼠的损伤小,模型成功率高。“足三里”穴位是普遍认可的具有镇痛作用的穴位之一,同时EA参数采用公认的、最有效的参数。本实验中没有选择其他的穴位及参数进行电针治疗效果的对比,同时仅选择了p38MAPK进行了研究,而未对MAPK家族中的其他成员进行研究,是本实验的缺点。我们将进一步完善此方面的研究。总之,本研究发现CCI大鼠背根神经节中p-p38MAPK蛋白表达增多,EA在改善机械痛觉过敏和热痛觉过敏以及改善大鼠受累后肢的运动功能的同时,抑制了背根神经节中p-p38MAPK蛋白表达,这可能是EA治疗NP的机制之一。

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